枇杷果肉总多酚提取及体外抗氧化活性研究

汤承浩

枇杷果肉总多酚提取及体外抗氧化活性研究

汤承浩1,2

（1. 凯里学院大健康学院, 贵州 凯里 556011; 2. 贵州省普通高等学校黔东南民族药综合利用工程技术研究中心，贵州 凯里 556011）

目的：以枇杷果肉为研究对象，辅以超声波法提取总多酚。方法：通过正交试验确定最优提取工艺条件：提取温度为60 ℃，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇体积分数60%，超声提取时间18 min，总多酚提取率达0.94%。通过1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）清除率的测定对枇杷果肉总多酚进行体外抗氧化活性评价。结果：枇杷果肉总多酚DPPH·清除率明显高于维生素C（Vc），且枇杷果肉总多酚 DPPH·半数抑制浓度（IC50=7.04 µg·mL-1）优于Vc（IC50=7.70 µg·mL-1）。结论：枇杷果肉总多酚是一种天然的抗氧化活性剂。

枇杷果肉； 总多酚； 提取工艺； 抗氧化活性

植物多酚的提取方法较多，主要包括超临界CO2萃取法[1]、超声波辅助提取[2]、超声协同酶法提取[3]、酶法辅助提取[4]、微波协同辅助提取法[5]、回流提取法[6]等，且由于超声波产生的机械振动能够快速、高效的破坏组织细胞结构，故而有利于加速多酚的提取，同时也可避免使用高温对多酚的毁坏[7]，因此，超声波提取法被广泛应用于植物多酚的提取。

近来，大多数研究人员主要对枇杷叶中熊果酸、齐墩果酸挥发油和β-葡萄糖苷酶[8-9]以及枇杷核中的总黄酮和总多酚[10-11]等部分进行提取研究，对枇杷果肉总多酚的提取工艺及其体外抗氧化活性研究目前少有报道。因此，本文采用L9（33）正交试验对枇杷果肉总多酚的超声辅助提取工艺进行优化，并采用DPPH·清除率来评价其抗氧化活性，为枇杷果肉多酚类化合物的综合开发利用提供重要依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

枇杷采自麻江县下司镇，经植物学博士鉴定为定为蔷薇科植物枇杷(Thunb.) Lindl.的成熟果实。枇杷果肉样品于50oC 鼓风干燥箱中干燥，再用小型植物粉碎机粉碎并过100目（150μm）筛，待用。DPPH、三氯乙酸、没食子酸和Folin﹠ciocalteu’s酚试剂均由上海阿拉丁生化有限公司提供；紫外-可见分光光度计（日本岛津UV-2550型）；粉碎机（科伟永兴仪器有限公司FW200型）；水浴振荡器（予华仪器有限公司SHA-C型）；超声波清洗器（上海科导仪器有限公司SK2510LHC型）；电子天平（奥豪斯仪器有限公司AR224CN型）。

1.2 试验方法

1.2.1 枇杷果肉总多酚的提取

取新鲜枇杷果肉洗净切片，50oC干燥。称取1 g粉碎过100目（150μm）筛的枇杷果肉，加入20 mL 体积分数为70%的乙醇溶液，270 W超声条件下60oC水浴提取14 min，离心，取上清液用蒸馏水定容至50 mL，取0.7 mL于50 mL量瓶中加12 mL蒸馏水，摇匀，加1 mL Folin-Ciocalteu（FC）试剂和4 mL 体积分数为10%的Na2CO3溶液，蒸馏水定容，避光2 h，测定总多酚提取率。通过改变溶剂浓度、料液比和提取时间等因素来探讨溶剂回流法提取生姜多酚的工艺条件。

式中：—多酚质量浓度。

1.2.2 枇杷果肉总多酚的测定

精确称量0.010 0 g没食子定容至100 mL。分别取该溶液0、0. 5、1.0、1. 5、2.0、2.5 mL于6个25 mL容量瓶中，加6.0 mL超纯水，摇匀，再加入0.5 mL FC试剂，加入2.0 mL 体积分数为10％的Na2C03溶液，用超纯水定容。避光2 h后于760 nm波长下测定吸光度，平行此操作3次后取平均值。以没食子酸浓度（）为横坐标，吸光度（）为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归得标准曲线方程：

= 72.5+ 0.111 2，相关系数² = 0.999 8。

在没食子酸质量浓度为2～10 μg·mL-1范围内该方法线性关系良好。

1.2.3 单因素试验设计

考察乙醇体积分数、提取时间和液料比等3个单因素的影响。

1）乙醇体积分数分别采用30%、40%、50%、60%、70%和80%的条件下进行比较，超声时间14 min，料液比1∶20（g∶mL）；

2）超声时间采用6、10、14、18、22和26 min的条件下进行比较，乙醇体积分数60%；

3）料液比采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL）的条件下进行比较，超声时间为18 min，乙醇体积分数为60%，从而确定料液比的影响。

1.2.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、提取时间和料液比进行3因素3水平做L9（33）正交试验优化提取条件，因素水平设计见表１。

表1 正交试验因素与水平

1.2.5 清除DPPH·能力试验

将超声辅助提取的枇杷果肉总多酚溶液分别配制成0.001 8、0.003 6、0.005 4、0.007 2、0.009 0 mg·mL-15种不同质量浓度。向2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）中分别加2.0 mL不同质量浓度的枇杷果肉总多酚溶液，混合反应30 min，并用紫外-可见分光光度计（517 nm）测其吸光度，记为Ai；同时测2.0 mL DPPH乙醇溶液（0.08 mg·mL-1）与2.0无水乙醇混合液的吸光度，记为Ao。以维生素Ｃ为阳性对照，枇杷果肉总多酚对DPPH·清除率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对枇杷果肉多酚提取影响

由图1分析可知，在乙醇体积分数为30%~60%范围内，随乙醇体积分数的增大总多酚提取率增大，当乙醇体积分数达到60%时，总多酚得率最大（9.5375 mg·g-1），之后随乙醇体积分数增大，提取率反而呈下降趋势。因此，选取乙醇体积分数50%、60％、70%３个水平作为正交试验。

图1 乙醇体积分数对枇杷果肉总多酚提取效果的影响

2.2 超声时间对枇杷果肉多酚提取效果的影响

由图2可知，随着超声时间的加长，枇杷果肉总多酚提取率逐渐升高，当超声时间为18 min时，多酚得率为9.6950 mg·g-1，达最大值；之后超声时间延长，总多酚提取率下降。因此，选取超声时间14、18、22 min３个水平继续正交试验。

图2 超声时间对枇杷果肉总多酚提取效果的影响

2.3 料液比对枇杷果肉多酚提取效果的影响

由图3可知，溶剂用量的不断增加，枇杷果肉中总多酚提取率提高，当料液比在1∶35（g·mL-1）时多酚得率最大，为9.992 5 mg·g-1，但随着溶剂用量的进一步增加，枇杷果肉总多酚提取率呈下降趋势。 因此，选取料液比1∶30、1∶35和1∶40（g·mL-1）３个水平进行正交试验。

图3 料液比对枇杷果肉总多酚提取效果的影响

2.4 枇杷果肉总多酚最优提取工艺的确定

采用表2的L9（33）因素水平进行正交试验，以枇杷果肉总多酚提取率为指标。从表2分析可知，枇杷果肉总多酚提取率的影响因素由大到小为料液比＞超声时间＞乙醇体积分数。枇杷果肉总多酚最优提取因素水平组合为A2B2C2，即料液比1∶35（g·mL-1）、超声时间18 min、乙醇体积分数60%。

表2 对枇杷果肉总多酚提取率的影响因素正交试验结果

2.5 验证性实验

在最佳提取工艺条件下（温度60oC、料液比1∶35（g·mL-1）、超声时间18 min、乙醇体积分数60%），用相同方法提取５个样品，测定多酚提取率分别为0.941 2%、0.942 4%、0.943 1%、0.945 3%和0.947 0%，平均提取率为0.943 8%，RSD值为0.25%，表明该最佳提取工艺稳定可靠。

2.6 枇杷果肉总多酚清除DPPH·能力评价

从图4可以看出，枇杷果肉总多酚质量浓度的提高，清除DPPH·的能力逐步增强，即清除率与总多酚的质量浓度间存在较明显的量效关系。当总多酚质量浓度小于0.009 mg·mL-1时，枇杷果肉总多酚的DPPH·的清除率优于对照品Vc。由插值法可得其清除DPPH·自由基的 IC50为7.04 μg·mL-1，稍大于Vc的IC50值7.70μg·mL-1，表明枇杷果肉总多酚可作为天然抗氧化剂使用。

图4 枇杷果肉总多酚对DPPH·清除作用

3 结论与讨论

本试验以枇杷果肉为原料，采用超声辅助提取法，通过单因素试验及正交试验讨论了枇杷果肉总多酚提取工艺条件，并确定最佳提取工艺为：提取温度为60oC，料液比1∶35（g·mL-1），乙醇体积分数60%，超声提取时间18 min，枇杷果肉总多酚提取率达0.943 7%。在该实验条件下进行验证性试验，重复5次，平均提取率为0.943 8%，RSD值为0.25%，表明该工艺具有提取率高，且稳定可靠等优点。抗氧化实验表明，枇杷果肉总多酚具有一定的清除DPPH·自由基的能力，且IC50值大于Vc的IC50值，表现出了较好的抗氧化活性。

在一定范围内，随着乙醇体积分数的增大，多酚的溶出量不断增加，这可能是醇溶性物质的溶出量随着乙醇体积分数的逐渐增大而增加，提取率呈增大趋势；但乙醇体积分数过大亦可导致枇杷果肉中的某些脂溶性物质溶出量不断增大，这些物质可与多酚类物质形成竞争关系，影响枇杷果肉多酚类物质的溶出。当超声提取时间较短时，总多酚提取量随超声提取时间增加而增大，但是当超声提取时间超过18 min时，枇杷果肉总多酚提取量反而下降，这可能是超声时间过长后，其具有的较强机械效应与热效应，使多酚类物质发生变质。

本研究结果表明，利用超声辅助方法提取枇杷果肉多酚类化合物具有提取率高、重现性好、多酚类物质结构稳定等优点，该法所得多酚类化合物具有较强的抗氧化生物活性，为枇杷果肉的综合开发利用和寻找高效的天然抗氧化剂提供科学的依据。

［1］李军, 冯耀声. 超临界二氧化碳萃取茶多酚的研究[J]. 天然产物研究与开发, 1996, 8(3): 42-47.

［2］胡月芳. 淮山多糖超声辅助提取及清除超氧阴离子自由基的作用[J]. 江苏农业科学, 2017, 45(4): 144-146.

［3］施伟梅, 吴龙火, 杨翔, 等. 超声协同酶法提取紫花苜蓿多酚及其抗氧化性质[J]. 草业科学, 2016, 33(3): 519-526.

［4］徐婕, 汤韧, 吉树臣, 等. 酶法辅助提取茶多酚的工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2016, 37(5): 86-91.

［5］王琴, 罗洁莹, 柳建良, 等. 响应面法优化超声-微波协同辅助提取金柚幼果总黄酮工艺[J].食品研究与开发, 2020, 41(2): 83-91.

［6］宋力, 薛灵芬, 李森, 等. 回流法提取菠萝皮中多酚及其含量的测定[J]. 信阳师范学院学报(自然科学版), 2016, 29(4): 592-595.

［7］范金波, 蔡茜彤, 冯叙桥, 等. 超声波辅助提取牛蒡根多酚工艺参数优化[J]. 食品与发酵工业, 2014, 9(11): 247-252.

［8］黄百祺, 黎朝旭, 肖婉娜, 等. S-8大孔树脂纯化枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的研究[J]. 轻工科技, 2020, 36(7): 3-6.

［9］宋宁, 刘语, 刘铮铮, 等. GC-MS方法分析新鲜枇杷叶挥发油及β-葡萄糖苷酶对枇杷叶的增香作用[J]. 中国林副特产, 2019 (5): 5-12.

［10］韩晓婷, 徐久婷, 魏凌云, 等.干制方法对枇杷叶总酚、黄酮等成分及抗氧化活性的影响[J].西北林学院学报, 2020, 35(1): 130-134.

［11］王萍, 王宇鹤, 李辉, 等. 枇杷核不同极性萃取物总黄酮、总多酚含量与其抗氧化活性的相关性[J]. 化学试剂, DOI: 10.13822/ j.cnki.hxsj.2020007520.

Extraction of Total Polyphenols Fromand Its Antioxidant Activity in Vitro

1,2

（1. School of Life and Health Science, Kaili University, Kaili Guizhou 556011, China; 2. Qiandongnan Engineering and Technology Research Center for Comprehensive Utilization of National Medicine,Kaili Guizhou 556011, China）

Objective: To extract total polyphenols fromby ultrasonic method. Methods: The optimum extraction conditions were determined by orthogonal test: extraction temperature 60 ℃, solid-liquid ratio 1∶35 (g·mL-1), ethanol volume fraction 60%, ultrasonic extraction time 18 min. Under above conditions, the extraction rate of total polyphenols was 0.94%. The antioxidant activity of total polyphenols fromwas evaluated by the determination of DPPH· scavenging rate. Results: DPPH· scavenging rate of total polyphenols inwas significantly higher than that of vitamin C (VC), and DPPH· 50 (IC50= 7.04 μg·mL-1) was better than VC(IC50 = 7.70 μg·mL-1). Conclusion: The total polyphenols inis a natural antioxidant.

; Total polyphenols；Ultrasonic extraction；Antioxidant activity

凯里学院2015年度科技合作协议项目（黔科合HL字[2015]7745号）资助。

2020-08-10

汤承浩（1986-），男，江苏省连云港市人，讲师，硕士研究生，2014年毕业于贵州大学农药学专业，研究方向：药物合成及活性研究。

R284.1

A

1004-0935（2020）09-1055-04