知母肉质量标准研究

黄晓婧，肖春霞，许 莉，高 鹏，罗 霄，赵小勤

(成都市食品药品检验研究院/中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045)

知母入药始载于《神农本草经》[1]，为百合科知母属植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎[2]，近代研究表明其化学成分主要为皂苷类、双苯吡酮类、生物碱类、氨基酸类等[3]，具有抗血小板凝聚、抗肿瘤、改善阿尔茨海默症、降糖等作用[4-6]。经市场调研，知母药材有毛知母、知母肉两种，炮制品有知母、知母肉切片和盐知母等多种规格[7]。通过文献考证，明·陈嘉谟在《本草蒙筌》[8]中提到知母肉的制作方法为“去净皮毛，忌犯铁器”，即早在明代已存在知母肉的炮制加工方式[9]。前期实验研究发现，知母肉饮片中知母皂苷BⅡ含量明显高于知母饮片[7]，表明知母肉的存在具有一定的合理性。《中国药典》2015年版一部知母来源项下明确注明知母肉的制作方法为“除去外皮，晒干”，但标准中并无知母肉的检验项目及规定。此外，北京市[10]、广西壮族自治区[11]、安徽省[12]、河南省[13]、湖南省[14]、重庆市[15]、天津市[16]、上海市[17]、贵州省[18]等多个地方饮片炮制规范中均提及知母肉，《欧洲药典》EP10.0[19]知母项下也同时收载了毛知母和知母肉两种规格。但多数标准仅有性状描述，项目设置简单且不统一。为进一步规范知母肉饮片炮制工艺，全面提高知母肉饮片质量，本研究参照《中国药典》2015年版一部知母质量标准相关项目对知母肉的质量标准进行研究，并对知母肉重金属及有害元素、植物生长调节剂残留、农药残留、黄曲霉毒素进行考察，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695-2998高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司)；Thermo 3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司)-德国Thermo ELSD 6000蒸发光散射检测器；薄层色谱数码成像系统(瑞士CAMAG公司)；AUX220电子天平(日本岛津公司，1/1万)；XPE26电子天平(梅特勒-托尼多仪器有限公司，1/100万)；SK250H超声仪(250 W，53 kHz，上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品

芒果苷对照品(98.4%，111607-201503)、知母皂苷BⅡ对照品(94.4%，111839-201505)由中国食品药品检定研究院提供；新芒果苷对照品(99.73%，MUST-16042232)由成都曼斯特生物科技有限公司提供；乙腈(色谱纯)；其余试剂(分析纯)；水(实验室自制纯净水)。

21批次知母肉中7批次为药材，14批次为饮片。来源信息见表1。

表1 知母肉来源信息

2 方法与结果

2.1 外观性状

《中国药典》2015年版无知母肉的性状描述，观察知母肉药材和饮片的外观特征，增加药材描述“形如毛知母。表面黄白色，有扭曲的沟纹，有的可见叶痕及根痕”及饮片描述“取净知母肉，润透，切厚片，干燥。本品形如知母饮片，表面黄白色，切面黄白色”。外观性状见图1。

A．知母(毛知母)药材；B.知母饮片；C.知母肉药材；D.知母肉饮片

2.2 显微鉴别

参照药典标准知母项下，为粉末显微鉴别，知母肉与毛知母显微无差别，为黏液细胞，胞腔内含草酸钙针晶束。显微鉴别见图2。

图2 知母肉显微鉴别

2.3 薄层色谱鉴别

参照药典标准知母项下方法，分别为芒果苷、知母皂苷BⅡ进行薄层色谱鉴别，经验证，知母肉在标准条件下薄层色谱主斑点清晰，分离效果好。薄层色谱见图3、图4。

1～3.样品S1～S3；4.芒果苷；5～7.样品S8～S10

1～3.样品S1～S3；4.芒果苷；5～7.样品S8～S10

2.4 检查项目

2.4.1 水分 按照《中国药典》2015年版第四部水分测定法(通则0832烘干法)测定，知母肉药材和饮片中水分含量测定结果见表2、表3。7批次药材水分含量在4.2%～8.9%之间，平均值为6.5%，符合药典规定的不得超过12.0%。14批次饮片水分含量在5.3%～11.6%之间，平均值为8.1%，根据测定结果，拟规定知母肉饮片水分含量不得超过12.0%。

表2 知母肉药材水分、灰分检查结果 (%)

表3 知母肉饮片水分、灰分检查结果 (%)

2.4.2 总灰分和酸不溶性灰分 按照《中国药典》2015年版第四部灰分测定法(通则 2302)测定，知母肉药材和饮片总灰分和酸不溶性灰分测定结果见表2、表3。7批次药材总灰分结果在2.7%～5.0%之间，平均值为3.8%，符合药典规定的不得超过9.0%。14批次饮片总灰分结果在2.5%～5.3%之间，平均值为3.6%。根据测定结果，拟规定知母肉饮片总灰分不得超过9.0%。

7批次知母肉药材酸不溶性灰分结果在0.2%～0.6%之间，平均值为0.4%，符合药典规定的不得超过4.0%。14批次饮片酸不溶性灰分结果在0.1%～0.6%之间，平均值为0.3%。根据测定结果，拟规定知母肉饮片酸不溶性灰分不得超过2.0%。

2.4.3 二氧化硫残留量 按照《中国药典》 2015年版四部二氧化硫残留量测定法(通则 2331第一法)测定。因本实验收集的药材均为产地趁鲜收集，实验室切片、干燥，未涉及到硫磺熏蒸加工环节，故共测定了5批次饮片的二氧化硫残留量。结果有2批次未检出，2批次检出量为3 mg/kg和10 mg/kg，还有1批次(样品S10)检出量为434 mg/kg，超出了药典规定的限量高值400 mg/kg。鉴于知母硫磺熏蒸的情况较严重[7]，建议标准增加二氧化硫残留量测定项。

2.4.4 重金属及有害元素 按照《中国药典》2015年版四部铅、镉、砷、汞、铜测定法(通则2321第二法)，检测了3批次知母肉药材和3批次饮片，结果均未检出。因此，建议标准暂不增加重金属及有害元素项。

2.4.5 植物生长调节剂 按照新建立的UPLC-MS-MS法测定8种植物生长调节剂残留，检测了3批次知母肉药材和3批次饮片，结果均未检出。

2.4.6 农药残留量 按照新建立的QuEChERS-GC-QQQ-MS/MS测定知母中58种农药残留方法[20]，检测了3批次知母肉药材和3批次饮片，结果均未检出。因此，建议标准暂不增加农药残留项。

2.4.7 黄曲霉毒素 按照《中国药典》2015年版四部黄曲霉毒素测定法第一法(通则2351)，检测了3批次知母肉药材和3批次饮片，结果均未检出。因此，建议标准暂不增加黄曲霉毒素限量项。

2.5 新芒果苷、芒果苷含量测定

2.5.1 色谱条件 以SHISEIDO CAPCELL PAK C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，0.2%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～7 min，7%(A)；7～10 min，7%～13%(A)；10～26 min，13%(A)；26～27 min，13%～7%(A)；检测波长为258 nm。理论塔板数按芒果苷峰计算应不低于6 000。

2.5.2 溶液制备 (1)对照品溶液：取芒果苷、新芒果苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含芒果苷25 μg、新芒果苷50 μg的混合溶液，即得对照品溶液。(2)供试品溶液：取样品粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，称定重量，立即超声处理40 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。对照品和供试品溶液色谱见图5。

1.新芒果苷；2.芒果苷

2.5.3 线性范围 精密称取新芒果苷对照品10.16 mg、芒果苷对照品7.26 mg，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液母液。将母液分别稀释至7个不同浓度溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算线性关系，结果见表4。

表4 新芒果苷和芒果苷的线性范围

2.5.4 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液适量(“2.5.3”项下)，按照“2.5.1”项下色谱条件连续进样6次。结果测得新芒果苷峰面积RSD为0.49%(n=6)，芒果苷峰面积RSD为1.23%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批样品(S1)6份，按照“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，“2.5.1”项下色谱条件分别进样测定，以外标法计算新芒果苷和芒果苷含量，测得6份样品新芒果苷平均含量为31.75 mg/g，RSD=0.72%；芒果苷平均含量为6.05 mg/g，RSD=1.00%。结果表明，本法的重复性良好。

2.5.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液(“2.5.5”项下)，按照“2.5.1”项下色谱条件分别于0、4、8、16、24 h进样，测定新芒果苷、芒果苷峰面积，RSD分别为0.33%、0.23%。另取新芒果苷对照品溶液(0.081 28 mg/mL)，芒果苷对照品溶液(0.058 08 mg/mL)，分别于0、4、8、16、24 h进样测定新芒果苷、芒果苷峰面积，RSD分别为0.39%、0.48%。结果表明，对照品和供试品溶液中的新芒果苷、芒果苷在24 h内稳定。

2.5.7 加样回收试验 精密称取已知含量的样品(S1)6份，每份取约0.1 g，置于锥形瓶中，分别精密加入新芒果苷对照品溶液(浓度为0.728 mg/mL)5 mL、芒果苷对照品溶液(浓度0.305 mg/mL)2 mL，再分别精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，立即超声提取40 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液测定峰面积，计算回收率。结果新芒果苷的平均回收率为101.36%，RSD为2.14%；芒果苷的平均回收率为101.24%，RSD为1.52%。结果表明，本法的准确度较好。

2.5.8 样品含量测定 取表1中的知母肉药材、饮片样品适量，每个样品平行2份，按照“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，“2.5.1”项下色谱条件进行测定，计算各批样品中新芒果苷和芒果苷的含量之和，结果见表5、表6。

表5 知母肉药材含量测定结果(以干燥品计) (n=2)

表6 知母肉饮片含量测定结果(以干燥品计) (n=2)

由表5、表6可见，知母肉药材中新芒果苷、芒果苷总量在2.15%～3.95%之间，平均值为2.76%，参照知母药材限度，拟规定知母肉药材新芒果苷、芒果苷总量不得少于1.20%。知母肉饮片中新芒果苷、芒果苷总量在1.86%～3.10%之间，平均值为2.63%，参照知母饮片限度，拟规定知母肉饮片新芒果苷、芒果苷总量不得少于1.50%。

2.6 知母皂苷BⅡ含量测定

取表1中的知母肉药材、饮片样品适量，按照《中国药典》2015年版一部知母项下知母皂苷BⅡ的含量测定方法测定，结果见表5、表6。由此，拟规定知母肉药材中知母皂苷BⅡ含量在5.3%～7.3%之间，平均值为6.6%，符合药典规定的知母药材不得少于3.0%。知母肉饮片中知母皂苷BⅡ含量在4.8%～7.1%之间，平均值为5.8%，符合药典知母饮片规定的不得少于2.0%。建议采用药典知母中知母皂苷BⅡ限度。

3 讨论

3.1 提取溶剂考查

分别考察样品制备中提取溶剂稀乙醇、50%甲醇、70%乙醇、50%乙腈、50%丙酮、0.2%磷酸溶液-乙腈(83∶17)的提取效果，测定含量，结果采用50%甲醇和0.2%磷酸溶液-乙腈(83∶17)为提取溶剂对新芒果苷提取效果差别不大，但50%甲醇对芒果苷提取效果更佳，因此选择50%甲醇为提取溶剂。

3.2 提取方式考查

分别考察超声处理(15 min、30 min、60 min)、加热回流(30 min、60 min、90 min)的提取效果，结果超声处理对芒果苷提取效果优于加热回流，加热回流对新芒果苷的提取效果优于超声处理。但因知母含黏液质较多，样品经加热回流后，供试品溶液变黏稠；加热回流30 min出现轻微拉丝现象，加热回流60 min和90 min溶液变得很黏稠，溶液拉丝，不易过滤。故实验采用超声处理提取方法。

4 结论

本研究收集了7批次不同产地的知母肉药材和21批次饮片，基于2015年版《中国药典》中收录的知母药材质量标准，对知母肉药材及饮片的质量标准进行了系统研究，补充和完善了已有的知母相关的国家及地方质量标准。根据实验结果初步确定知母肉的鉴别、含量测定和检查项判定标准：供试品薄层色谱在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点；含量测定供试品按干燥品计算，药材含新芒果苷、芒果苷总量不得少于1.20%，饮片不得少于1.50%；药材含知母皂苷BⅡ不得少于3.0%，饮片不得少于2.0%；水分不得超过12.0%；总灰分不得超过9.0%；酸不溶性灰分不得超过4.0%，饮片不得超过2.0%；二氧化硫不得超过400mg/kg。