高效液相色谱法同时测定中成药金莲清热胶囊中3种成分

李 琳，曹娅娟，李怡婧，阴 娇

(宁夏启元国药有限公司，宁夏 银川 750000)

金莲清热胶囊是在宁夏启元国药有限公司研制的金莲清热颗粒的基础上，改变剂型开发的中药新药。该药由金莲花、大青叶、生地黄等组成，通过加水煎煮，过滤，浓缩，干燥，加入适量的辅料制成颗粒后，再灌装入胶囊制成。其中金莲花作为金莲清热胶囊的君药之一，其主要指标性成分为荭草苷、牡荆苷，具有清热解毒、抗菌消炎的功效[1-2]；生地黄作为佐药之一，具有润燥、清热生津的功效，其主要指标性成分为毛蕊花糖苷[3]。金莲清热胶囊质量标准一直为国家部颁标准(YBZ01712008)，未载入《中国药典》中，其标准中仅对臣药知母中的菝葜皂苷元进行了含量测定，采用的是薄层双波长扫描法。该方法不仅用到大量致癌有毒试剂——苯反复提取，造成检测效率较低，且含量测定指标不能准确反映临床疗效，因此改进含量检测方法，选择多种关键药效成分进行定量分析，能够有效控制金莲清热胶囊的质量[4]。

1 仪器与试药

岛津LC-20A，包括二元泵，自动进样器，紫外检测器，Labsolution工作站，电子天平METTLER TOLEDO AG104(101 g～0.1 mg)；KQ-300DE型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

荭草苷(批号：111777-201302，含量：97.9%)，牡荆苷(批号：111687-201603，含量：95.7%)，毛蕊花糖苷(批号：111530-201512，含量：96.7%)购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈(均为Guangdong Guanghua Sci-Tech Co.，LTD色谱纯)；水为公司自制纯化水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch(月旭)C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.2%冰醋酸溶液，线性梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长：340 nm；流速：1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

混合对照品溶液配制：取荭草苷对照品、牡荆苷对照品、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含50 μg的混合溶液，即得。

供试品溶液配制：取金莲清热胶囊适量，除去囊壳，内容物研细，精密称定0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入30 mL水，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)60 min，过滤，取续滤液20 mL至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30 mL，30 mL，20 mL)，合并乙酸乙酯提取液，水浴80 ℃蒸干，用甲醇转移至10 mL量瓶中，定容，用0.45 μm滤膜过滤，即得。

阴性溶液制备：按处方比例和制法分别制备不含金莲花、大青叶和地黄的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液，按照本研究方法测定，并在二极管阵列检测器上分析色谱峰。结果表明，方中其他成分不干扰荭草苷、牡荆苷和毛蕊花糖苷的测定。色谱见图1。

2.3 线性关系考察

分别精密称取荭草苷、牡荆苷及毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇稀释定容，制备混合对照品母液20 mL(红草苷浓度1.008 mg/mL、牡荆苷浓度0.805 mg/mL、毛蕊花糖苷浓度0.062 mg/mL)。精密量取混合对照品溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于1 0mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪中，按照拟定的色谱条件测定，记录峰面积。计算回归方程，详见表2。

注：1.荭草苷；2.牡荆苷；3.毛蕊花糖苷。A.混合对照溶液；B.缺地黄阴性对照溶液；C.缺金莲花阴性对照溶液；D.供试品溶液。

表2 线性关系考察结果

2.4 精密度实验

取上述混合对照品溶液，连续进样6次，按本研究所用方法测定。以峰面积计算，荭草苷、牡荆苷和毛蕊花糖苷的RSD分别为0.5%、0.8%和0.9%。结果表明该方法精密度良好。

2.5 重复性实验

取同一批样品(金莲清热胶囊，批号：170216)，精密称定0.5 g左右样品6份，按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，测定。结果荭草苷、牡荆苷和毛蕊花糖苷每粒平均含量分别为0.655、0.251、0.081 mg，RSD分别为0.4%、0.5%、1.3%(n=6)，说明本方法重复性良好。

2.6 加样回收率实验

精密称取已知荭草苷含量的同一批号(含量：0.66 mg/粒)样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入荭草苷对照品溶液(0.208 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法测定，计算荭草苷的加样回收率。精密称取已知牡荆苷含量的同一批号(含量：0.26 mg/粒)样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入牡荆苷对照品溶液(0.081 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法测定，计算荭草苷的加样回收率。精密称取已知毛蕊花糖苷含量的同一批号(含量：0.082 mg/粒)样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入毛蕊花糖苷对照品溶液(0.031 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法测定，计算荭草苷的加样回收率。见表3。

3 讨论

3.1 波长选择

表3 金莲清热胶囊中3种成分的加样回收率测定结果

将荭草苷、牡荆苷和毛蕊花糖苷的标准品溶液分别在190～400 nm处进行扫描，荭草苷最大吸收波长为348 nm，牡荆苷最大吸收波长为337 nm，毛蕊花糖苷最大吸收波长为329 nm，经过反复摸索，最终确定340 nm作为检测波长，在该波长下，所测各成分分离效果好，分离度达到要求。

3.2 提取因素考察

本研究对以下提取方法进行了考察：甲醇超声-水饱和正丁醇提取、乙酸乙酯∶70%乙醇=1∶2混合溶液提取、甲醇超声提取[5]、大孔树脂吸附-乙酸乙酯提取、乙酸乙酯提取。结果表明以乙酸乙酯-70%乙醇为提取溶剂，所测得待测成分含量较高，但单用乙酸乙酯提取得到的样品，杂质峰干扰较小且待测成分含量也较高，因此最终采用乙酸乙酯作为提取溶剂。

3.3 流动相的考察

样品处方中共有7味药材，成分复杂，性质相近的成分多，流动相先后以等度洗脱方式：甲醇-0.4%磷酸[6]、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸，未能得到良好分离效果，结合提取方法及色谱条件的考察，最终选择乙腈-0.2%冰醋酸，梯度洗脱，系统分离效果较好。

本研究建立了金莲清热胶囊中多种指标成分同时测定的方法，以表征金莲清热胶囊的质量，多组分同时测定还可以反映复方中药的配伍状况，方法简单，结果准确可靠，适于产品的含量测定及质量控制。