六味地黄丸浓缩丸多指标成分体外溶出度研究

吴崇乐，黄 胜*，颜冬兰，胡丽彬，罗菲菲，叶惠煊

(1.九芝堂股份有限公司，湖南 长沙 410205；2.湖南省中药固体制剂工程技术研究中心，湖南 长沙 410205；3.中药验方湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410205)

随着中药质量控制技术的发展，许多化学药品的质量控制理念与方法在中药质量控制中得到逐步应用，如溶出度方法已逐渐应用于中药筛选制剂处方与工艺和内在质量评价[1-2]。但溶出度在中药丸剂的研究和应用较少，2015版《中国药典》四部通则中，丸剂项仅规定了溶散时限的控制指标[3]。从临床用药情况分析，现行的溶散时限检查不能全部反映体内的吸收和药效情况，而溶出度试验更能反映体内药物的吸收情况。

六味地黄丸是传统中医滋阴补肾的经典名方，始见于宋代钱乙的《小儿药证直诀》，由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻六味中药材组成，主治肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴等证[4]。目前，对六味地黄丸质量评价如指纹图谱研究的报道较多[5-8]，但仅有少数关于六味地黄丸溶出度的报道研究，且主要集中在对丹皮酚单一成分或者丹皮酚、马钱苷2种成分的溶出度进行评价[9-15]。

本实验建立以马钱苷、莫诺苷和丹皮酚为指标成分的溶出度测定方法，同时测定六味地黄丸马钱苷、莫诺苷和丹皮酚的体外溶出度，为六味地黄丸的质量控制和评价提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZRS-8LD智能溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司)；BS2202S电子天平(赛多利斯科仪器(北京)有限公司)；KQ-700DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Waters 2695-2998液相色谱仪(美国沃特斯公司)。

1.2 试剂与药品

六味地黄丸：浓缩丸(厂家1，批号201903046；厂家2，批号19073262)。丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号110708-201407)。马钱苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号111640-201707)。莫诺苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号111998-201602)。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参照《中国药典》2015版六味地黄丸浓缩丸含量测定方法。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取莫诺苷对照品10.35 mg、马钱苷对照品10.31 mg和丹皮酚对照品20.25 mg，加入50%甲醇50 mL，溶解，摇匀，配制成每1 mL中含莫诺苷、马钱苷、丹皮酚分别为0.207 mg/mL、0.206 2 mg/mL、0.405 mg/mL的混合溶液，即得。并稀释至刻度，摇匀即得对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 参照《中国药典》2015版四部0931(第二法)溶出测定法，以脱气处理的pH=1.2盐酸-氯化钠溶液500 mL为溶出介质，温度保持在(37±0.5)℃，转速100 r·min-1，取供试品6份，每份约10 g，分别投入6个溶出杯内，立即启动旋转并开始计时，在规定时间点吸取溶液5 mL(每次取样结束补充同温同体积的释放介质)，上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL对照品储备液置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，进样10 μL，测定峰面积。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标进行线性回归，得回归方程及相关系数见表1。结果表明莫诺苷在3.519～31.671 μg/mL，马钱苷在4.005～36.045 μg/mL，丹皮酚在12.5～112.5 μg/mL范围内有良好的线性关系。

表1 对照品溶液线性关系考察结果

2.4 精密度试验

取丹皮酚、马钱苷、莫诺苷混合标准溶液连续进样6次，每次10 μL。结果莫诺苷的RSD为0.48%，马钱苷的RSD为0.65%，丹皮酚的RSD为0.43%。

2.5 稳定性试验

取溶出时间为4 h的六味地黄丸的溶出液于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h进样测定。结果莫诺苷的RSD为3.52%，马钱苷的RSD为3.89%，丹皮酚的RSD为4.26%。表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

取同一批供试品 (批号：201903046)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份，并进行含量测定，记录峰面积，分别计算莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量，其含量测定结果的RSD值分别为0.95%、1.23%和1.58%。

2.7 加样回收率试验

精密称定已知含有量的六味地黄丸粉6份，分别精密称定加入丹皮酚、马钱苷、莫诺苷对照品，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇充分溶解并稀释至刻度，过滤，取续滤液1 mL加甲醇稀释至10 mL，混匀，取10 μL进样，测定峰面积，根据回归方程计算马钱苷、莫诺苷、丹皮酚的量及回收率，结果表明回收率良好。见表 2。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)

2.8 溶出度的测定

按“2.2.2”项下操作，分别于5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、2 h、4 h取样5 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，随即补充等量的溶出介质，取续滤液10 μL进样。按照“2.1”项下色谱条件测定峰面积，求算药物质量浓度并换算成不同时间的累积溶出百分率，取平均值。结果见表3。

表3 不同厂家六味地黄丸浓缩丸多指标的累积溶出度 (n=6)

绘制溶出曲线。以表3中平均累积溶出度(%)为纵坐标，时间为横坐标(min)绘制溶出曲线。不同厂家六味地黄丸浓缩丸中莫诺苷、马钱苷、丹皮酚的溶出曲线分别见图1、图2、图3。

图1 六味地黄丸浓缩丸中莫诺苷的溶出曲线

图2 六味地黄丸浓缩丸中马钱苷的溶出曲线

图3 六味地黄丸浓缩丸中丹皮酚的溶出曲线

2.9 相似度评价

采用相似因子法进行分析[16]，比较2个厂家六味地黄丸浓缩丸的溶出度。

以厂1浓缩丸(批号：201903046)作为参比制剂，根据上述公式计算各溶出指标的f2值，结果见表6。莫诺苷、马钱苷、丹皮酚的相似因子均大于75，表明不同厂家六味地黄丸浓缩丸中莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的溶出行为相似。

表6 六味地黄丸浓缩丸多指标相似因子

3 讨论

根据累积溶出度计算公式，累计溶出度理论最大值应为100%。本次试验计算不同厂家六味地黄丸浓缩丸中莫诺苷、马钱苷的累积溶出度均存在超过100%，其中莫诺苷达到250%以上。研究[17]表明，当溶液pH=1～4时，莫诺苷、马钱苷的含量均呈增加趋势，pH=1～2时，呈明显增加趋势。本次试验选用的溶出介质为pH=1.2，推测酒萸肉中含有多种莫诺苷衍生物在酸性条件下转化为莫诺苷。此外，在给药剂量范围内，莫诺苷衍生物在酸性条件下转化为莫诺苷，对人体安全无害。

溶出时间的确定。张启明等[17-18]认为，在酸性介质(pH =1. 0～3. 0)中的最长测定时间建议为2 h，在前期的预实验中，发现随着时间的增加，溶出率相应增加，4 h时溶出曲线趋于平稳，6 h溶出率与4h溶出率差值仅为1%。因此，本实验溶出时间设定为4 h。

本实验采用f2相似因子法评价不同厂家六味地黄丸指标成分的释放规律，结果表明，3个指标成分的f2均大于70，说明不同厂家制剂之间释药行为相似，但溶出曲线趋势略有差异，可能与不同厂家在制剂过程中的工艺参数、设备差异有关。

本实验选择与胃液酸性接近的pH=1.2的盐酸-氯化钠溶液作为溶出介质，参照2015版《中国药典》六味地黄丸的含量检测指标考察六味地黄丸浓缩丸的溶出度变化，但在此环境下，酒萸肉中的多种莫诺苷衍生物转化后为莫诺苷，不能较好地评价莫诺苷的释放度。因此，建议选择六味地黄丸中其他具有代表性的、在该环境下稳定的活性成分作为考察指标。