血清miR-182-5p表达水平对脓毒症患儿继发急性肾损伤的早期预测价值①

陈小冰 张雪梅 陈求凝 谢邦贵 卢玉朱

(海南省第三人民医院新生儿科，三亚 572000)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒症最常见、最严重的并发症之一，在脓毒症患儿中的发病率及病死率均较高，严重威胁患儿的生命健康[1]。早期诊断及干预是改善AKI预后的关键。目前，国内仍使用血肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素C(cystatin C，Cys-C)及肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)评价早期肾损伤，但敏感性不高，无法满足临床需求。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)作为新型的基因调控分子，广泛参与细胞增殖、凋亡及免疫炎症反应等多种生物学过程的调控，在肾脏疾病的发生、发展及预后中发挥重要作用[2，3]。有研究发现，miR-182-5p通过多种机制参与AKI的发生发展，是AKI 发病的重要调控因子，为理解AKI的发病机制提供了新的视角[4]。本研究通过观察脓毒症患儿血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平分析其对AKI的早期预测价值，以期为脓毒症患儿继发AKI的诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 选取2016年1月～2019年6月海南省第三人民医院收治的脓毒症患儿196例，其中男性126例，女性70例，年龄8个月～14岁，平均年龄(6.20±1.58)岁。儿童脓毒症的诊断参考儿童脓毒性休克诊治专家共识(2015版)，纳入标准：①白细胞计数升高或下降，发热(肛温>38.5℃)或低体温(肛温<35℃)；②心动过速(低体温者可以无心动过速)，伴随至少一个脏器功能异常(意识改变、低氧血症、血清乳酸增高或洪脉)。排除标准：①长期使用激素、免疫抑制剂者；②有慢性肾脏病史，接受过肾脏手术、近期接受造影剂检查及使用过肾毒性药物者；③伴有恶性肿瘤、血液系统疾病、慢性肝病及自身免疫性疾病者[5]。本研究经我院伦理委员会批准，所有患儿家属知情同意。

1.1.2试剂与仪器 ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；BR100207 PCR试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；RNeasy试剂盒、miRNA Easy试剂盒和TRIzol试剂盒均购自美国Qiagen公司；miR-182-5p引物由上海远见生物公司合成；离心机为美国ABI公司产品。

1.2方法

1.2.1收集资料及分组 参考2012版《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》制定的AKI诊断标准进行分组[6]。肾功能在48 h内突然减退，表现为Scr绝对值升高(≥26.5 μmol/L)，或Scr较基础值升高≥50%；或尿量减少(<0.5 ml/kg·h)，并持续>6 h。设AKI的脓毒症患儿为AKI组(72例)，未继发AKI的脓毒症患儿为非 AKI 组(124例)。记录所有患儿入院时的年龄、性别、体质指数、基础疾病、感染部位、心率、呼吸、体温、尿量、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(acute physiology and chronic health scoring system Ⅱ，APACHEⅡ)及序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment，SOFA)等基本情况。

1.2.2qRT-PCR检测miR-182-5p miR-182-5p引物上游：5′-ACTACTTCGACTGAGACACG-3′，下游：5′-GTCTGCATGCTGTCCTTG-3′。所有患儿均于入院次日采集空腹静脉血5 ml置于未加抗凝剂的离心管中3 500 r/min离心10 mm分离血清，-80℃冰箱保存备用。qRT-PCR检测miR-182-5p含量。根据PCR试剂盒说明书设置20 μl反应体系,扩增条件为：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃复性60 s进行45个循环，实验重复3次。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-182-5p的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3观察指标 所有患儿均于入院次日采集空腹静脉血5 ml置于未加抗凝剂的离心管中，37℃水浴30 min，以离心半径13.5 cm，3 500 r/min离心10 min，分离血清保存于-80℃冰箱待检。采用微粒子酶免疫分析法检测Scr及Cys-C水平，ELISA检测KIM-1水平。

2 结果

2.1AKI组和非AKI组临床一般资料比较 两组患儿的性别、年龄、体质指数、感染部位、心率、呼吸及体温差异均无统计学意义(P>0.05)；尿量、APACHEⅡ评分及SOFA评分差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 AKI组和非AKI组临床一般资料比较

2.2AKI组和非AKI组血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平比较 AKI组患儿血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明显高于非AKI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 AKI组和非AKI组血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平比较

2.3多因素Logistic回归分析比较脓毒症患儿继发AKI的危险因素 对AKI组和非AKI组有影响的因素分别为尿量、APACHEⅡ评分、SOFA评分、miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1，差异均有统计学意义。多因素Logistic回归分析发现血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平升高是脓毒症患儿继发AKI的独立危险因素，其OR(95%CI)值分别为2.903(1.870～5.116)、1.704(1.105～2.940)、2.063(1.434～3.970)、2.530(1.524～4.613)。见表3。

表3 多因素Logistic回归分析脓毒症患儿继发AKI的危险因素

2.4血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平对AKI的早期预测价值 血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测脓毒症患儿继发AKI的最佳截值分别为1.04、325.60 μmol/L、1.24 mg/L、16.50 μg/L，其中血清miR-182-5p表达水平预测脓毒症患儿继发AKI的敏感度和特异度较好。4项指标联合预测脓毒症患儿继发AKI的AUC(0.956，95%CI：0.903～0.997)明显高于单项miR-182-5p(0.852，95%CI：0.791～0.912)、Scr(0.735，95%CI：0.675～0.797)、Cys-C(0.796，95%CI：0.741～0.853)及KIM-1(0.817，95%CI：0.763～0.882)，差异有统计学意义(Z=4.827、7.374、6.418、6.205，P<0.05)，其敏感度和特异度分别为96.4%和90.8%。见表4。

表4 血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平对AKI的早期预测价值

2.5血清miR-182-5p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1的相关性分析 Pearson相关分析显示，AKI组血清miR-182-5p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1均呈正相关(r=0.683、0.975、0.874，P<0.01)，见图1。非AKI组血清miR-182-5p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1均无明显相关性(r=0.106、0.131、0.162，P>0.05)。

图1 血清miR-182-5p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1的相关性

3 讨论

脓毒症患儿继发AKI是一种常见急危重症，其病情进展迅速，病死率较高，已成为儿童死亡的主要原因之一。由于目前缺乏对AKI早期预测的敏感特异指标，临床实践中往往会错过对AKI早期诊断及干预的最佳时机。因此，探索一种敏感度和特异度强的生物标志物以提高对脓毒症患儿AKI的早期识别能力，对改善脓毒症患儿预后至关重要。miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的内源性单链非编码RNA，通过影响细胞缺血缺氧、细胞分化、增殖、代谢和凋亡等多种病理过程或信号通路参与AKI调控[7，8]。有研究表明，miRNA是AKI发病的重要调控因子，其通过多种机制参与不同病因导致的AKI，是AKI早期诊断和预后判断的生物标志物[9]。Wilflingseder等[10]研究发现，miR-182-5p是移植后AKI的调节因子，与AKI期间的整体基因表达变化密切相关，在AKI发病机制和组织修复过程中发挥关键作用，有望作为AKI新的生物标志物和治疗新靶点，发展前景广阔。亦有研究认为，miRNA在 AKI中表达异常，在AKI的发生发展中发挥重要作用，为早期干预AKI进展提供新思路，有望作为AKI早期诊断和预后评估的生物标志物[11]。

本研究显示，AKI组血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平明显高于非AKI组，提示血清miR-182-5p可能参与AKI的发生发展。Zhang等[12]研究表明，miRNA在脓毒症继发AKI中显著升高，可反映疾病的严重程度，其水平越高脓毒症患者死亡率越高，可能成为AKI新的诊断标志及治疗靶点。Xie等[13]研究认为，KIM-1能迅速反映近曲小管损伤，对肾脏功能损害具有较高的特异度和敏感度，可用于AKI的早期预测。本研究多因素Logistic回归分析发现血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平升高是脓毒症患儿继发AKI的独立危险因素。李大勇等[14]研究显示，miRNA表达升高是脓毒症患者发生AKI的独立危险因素，可作为AKI的早期预测因子，具有较高的诊断效能。王军宇等[15]研究发现，Cys-C及KIM-1水平升高是AKI的独立危险因素，且与AKI的严重程度有关，可作为预测急诊危重症患者7 d内AKI发生的敏感指标。本研究ROC曲线分析显示，血清miR-182-5p、Scr、Cys-C及KIM-1水平预测脓毒症患儿继发AKI的最佳截值分别为1.04、325.60 μmol/L、1.24 mg/L、16.50 μg/L，四项联合预测脓毒症患儿继发AKI的曲线下面积(0.956，95%CI：0.903～0.997)最大，其敏感度和特异度较高。Pearson相关分析显示，AKI组血清miR-182-5p表达水平与Scr、Cys-C及KIM-1均呈正相关，进一步说明miR-182-5p与Scr、Cys-C及KIM-1联合检测有助于提高AKI早期诊断的准确性。Ren等[16]研究表明，在肾损伤发生后很短时间内可检测miRNA表达水平，miRNA可作为血肌酐和尿量的辅助指标，有助于AKI的早期诊断、预后判断和监测病情发展。Zheng等[17]研究发现，血清miRNA表达量在肾缺血再灌注损伤的不同阶段及不同缺血时间会发生不同程度的变化，与AKI病情严重程度相关，有望成为新的AKI诊断、分类和预后判断的工具。另有研究显示，脓毒症患者AKI组血清Cys-C、尿液KIM-1水平明显高于非AKI组，能更早的反映肾脏损伤情况，检测该指标有助于判断脓毒症患者是否发生AKI[18]。

综上所述，血清miR-182-5p表达在脓毒症患儿继发AKI中明显升高，是脓毒症患儿继发AKI的独立危险因素，有望作为AKI早期预测的新型生物标志物。miR-182-5p联合Scr、Cys-C及KIM-1水平对预测AKI具有较高的价值，同时也为阐明AKI发病机制及治疗靶点提供了新的角度。