HPLC法测定牛黄解毒片中大黄素的含量

雷 杨，韩 宇，殷 丹*

（1.通化市食品药品检验所，吉林 通化 134000；2.吉林市食品药品检验所，吉林 吉林 132000）

1 仪器、试剂

紫外-可见分光光度计；高效液相色谱仪为A g i lent1200、Agilent1200SL和Ultimate3000；大黄素对照品来自中国药品生物制品检定所，甲醇为色谱纯，其余相关试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱：C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；检测波长：254 nm。

2.2 对照组

参照《中国药典》[1]2015年版一部中大黄项下，称定适量大黄素对照品加甲醇制成浓度为80 μg/mL的对照品溶液。

2.3 牛黄解毒片供试品

参照《中国药典》2015年版一部中大黄项下，称定牛黄解毒片供试品研成的粉末2.0 g，加50 mL甲醇。加热回流60 min，冷却后定容并进行震荡，并予以过滤两次，留取续滤液。量取5 mL滤液，加入10 mL盐酸（浓度8%），超声处理120s，再加三氯甲烷10 mL，再次进行加热回流60 min。待其冷却后采用分液漏斗进行分层。留取三氯甲烷层，剩下的溶液再以同法进行萃取2次。将得到的三氯甲烷层进行合并，合并后进行减压蒸馏，以回收三氯甲烷溶剂。将回收完毕的溶液残渣加入10 mL甲醇，定容摇匀。最后经过滤两次，得到的续滤液就是供试品溶液。

2.4 相色谱仪峰

取2.2的对照品溶液和2.3供试品溶液各5 uL注入液相色谱仪峰形好，能达到很好分离。

2.5 耐用性试验

我们分别以不同仪器不同品牌色谱柱、柱温和流速的变化来考察方法的耐用性。

色谱柱采用三个品牌：①Agilent，ZORBAX，SBC18（4.6×250 mm，5 μm）、②Welch UltimateAQ-C18（同规格）、③Diamonsil C18（同规格）在三个品牌的液相色谱仪进行了测定，显示供试品色谱图主峰分离良好，说明方法具有较好的耐用性，理论板数暂定为不得低于3000。

3 系统适用性试验

3.1 提取方法考察

为得到的更好的提取效果，本文对牛黄解毒片加热回流和超声震荡分别处理60 min的结果进行了考察，结果显示前者的提取效果更佳，主峰面积更大，杂质峰较少。因此确定其为供试品提取方法。

3.2 检测波长的确定

取大黄素对照品溶液，在250 nm～300 nm的吸收情况进行测定，显示其在254.3 nm时吸收峰最强，故而取254 nm。

3.3 流动相的确定

经对比考察85：15的甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液两种的测定效果，结果以甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）为流动相时的效果较好，干扰性小，色谱峰保留时间适宜。

4 方法学验证

4.1 线性

结果显示大黄素在0.11597～1.12547 mg，线性关系达到标准。

4.2 精密度

取同一供试品，依正文方法独立测定6份，数据显示本法重复良好。见表1。

表1 重复性试验结果（%）

4.4 准确度试验：

取同一供样品6份1 g，分别加入大黄素对照品适量，按正文方法进行测定，计算回收率。结果中表明，本方法中大黄素的回收率平均值为99.7%（RSD=0.3%）该方法适合于供样品中大黄素的含量测定。见表2。

表2 加样回收试验结果（%）

样品中含量测定

4.5 稳定性考察：

取10 μL供试品溶液，在放置0，4，10，14，16，24 h进样，计算峰面积的RSD值。结果表明其在24h内稳定。

5 讨 论

大黄是牛黄解毒片的主要成分之一。做好大黄的质量控制，对于保障牛黄解毒片的功效有重要意义。我们建立了HPLC法测定牛黄解毒片中大黄素含量的方法，经对提样方法、流动相及检测波长都进行了考察比较，按正文条件进行测定，提取完全，干扰小，含量高，方法相对简便。