微生物发酵法生产L-异亮氨酸的研究进展

孔 帅，方应浩，周 航，许鹏飞，杨 潇，任立伟，龚大春*

（1.三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学 湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌 443002；3.三峡大学 中国轻工业功能酵母重点实验室，湖北 宜昌 443002）

FISCHER于1901年第一次从蛋白质的水解液中发现了和L-亮氨酸旋光度不同的物质[1]，L-异亮氨酸这种物质由此问世。L-异亮氨酸作为人和动物体内所必需的分支氨基酸之一，在食品、牲畜饲料和医药等领域具有广泛的市场及应用前景[2]。如功能性饮料中添加L-异亮氨酸，能有效的防止肌肉损伤，提高运动员的耐力[3]；毛湘冰等[4]在仔猪饲料中添加适量L-异亮氨酸能改善其回肠屏障功能，能有效预防轮状病毒引起的腹泻疾病；L-异亮氨酸还能在葡萄糖协同作用下促进人体内胰岛素的分泌，达到迅速降低血液中的血糖浓度的目的，因而能有效的预防肥胖人群易得的突发性高血糖病症[5]。

L-异亮氨酸在1904年第一次被EHRLICH从甜菜糖浆中分离出来[6]。随着对制造L-异亮氨酸的不断深入研究，人们开始在工业上大规模的生产L-异亮氨酸。相比利用蛋白质水解法和化学合成法生产L-异亮氨酸，微生物发酵法在生产过程中绿色环保、成本大大减少、反应易控制以及能适用于大规模的生产，是现在工业上生产L-异亮氨酸的主要方法。微生物发酵法包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法因前体物作为中间代谢产物能够直接参与L-异亮氨酸的合成，故而L-异亮氨酸生物合成路径中的关键酶受到的反馈调节作用较小，能较快的生成终产物，但前体物价格昂贵，并不适用于大规模的工业发酵。相对于添加前体物发酵法，利用直接发酵法生产L-异亮氨酸的成本要少的多，得以被大多数企业采纳用来生产L-异亮氨酸。本文对L-异亮氨酸的生物合成途径及调控机制、菌种选育现状以及发酵控制工艺进行了综述，并结合自身相关科研经验对L-异亮氨酸未来的生产提出展望。

1 L-异亮氨酸的生物合成途径

1.1 L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控

生产L-异亮氨酸的菌株主要是谷氨酸棒杆菌（Cor-ynebacterium glutamicum）和大肠杆菌（Escherichia coli）。谷氨酸棒杆菌具有无内毒素、代谢同工酶少，有利于解除反馈抑制或转录衰减以及关键代谢酶抗反馈抑制能力强等特点，因此大多数研究者倾向于研究谷氨酸棒杆菌及其亚种，如黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）和乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）[7]等。谷氨酸棒杆菌中关于L-异亮氨酸在的生物合成路径及其代谢调控机制（见图1）。谷氨酸棒杆菌以葡萄糖作为原料，在一系列酶催化反应之后，通过糖酵解途径（embden-meyerhof pathway，EMP）、磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，HMP）和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）等途径生成草酰乙酸。草酰乙酸在谷草转氨酶（glutamate oxaloacetate aminotransferase，GOT）的作用下接受来自谷氨酸的氨基生成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸再经过10步酶催化反应生成L-异亮氨酸。

图1 谷氨酸棒杆菌中L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制Fig.1 Biosynthetic pathway and metabolic regulation mechanism of L-isoleucine in Corynebacterium glutamicum

1.2 L-异亮氨酸的生物合成途径中的关键酶

在L-异亮氨酸的生物合成路径中，关键酶的活性会影响主代谢流的碳通量的大小，进而影响最终产物的合成，因此解除或减弱关键酶的反馈调节或强化其酶活活性能增大碳通量，L-异亮氨酸的积累也将增加。在谷氨酸棒杆菌中，影响L-异亮氨酸合成路径中主代谢流碳通量大小的关键酶有天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高丝氨酸脱氢酶（homoserine dehydrogenase，HD）、高丝氨酸激酶（homoserine kinase，HK）、苏氨酸脱氢酶（threonine dehydrogenase，TD）和乙酰羟酸合酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS）等，其酶活活性受到反馈调节[8]。

1.2.1 天冬氨酸激酶

AK的编码基因为LysC，其组成是两个α亚基和两个β亚基组成的异四聚体，能将天冬氨酸催化为天冬氨酸磷酸，其酶活活性受到赖氨酸以及苏氨酸的协同反馈抑制。以临界致死浓度的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸作为筛选压力来获得具有目标抗性能力的L-异亮氨酸高产菌株，能在基因水平上解除或减弱赖氨酸和苏氨酸对AK的协同反馈抑制[6]。也可以通过选育赖氨酸营养缺陷型菌株，若赖氨酸无法生成，碳流将更多的流向前体物苏氨酸，增加终产物L-异亮氨酸的积累。

1.2.2 高丝氨酸脱氢酶

高丝氨酸脱氢酶（HD）由基因hom编码，能利用还原型辅酶二作为还原力将天冬氨酸-β-半醛脱羧催化为L-高丝氨酸[7]，其酶活活性受苏氨酸的反馈抑制以及蛋氨酸的反馈阻遏。用临界致死浓度的α-氨基-β-羟基戊酸、苏氨酸氧肟酸盐等结构类似物筛选优势抗性突变株能在基因水平上解除或减弱HD受到的反馈抑制[6]。也可以选育蛋氨酸营养缺陷型菌株，菌体内蛋氨酸无法形成，则主代谢流的碳流会更加通畅，终产物L-异亮氨酸的生物合成量也将增加。

1.2.3 高丝氨酸激酶

高丝氨酸激酶（HK）由基因thrB编码，能将L-高丝氨酸催化成为高丝氨酰磷酸，其酶活活性受苏氨酸的反馈抑制。经酶学动力学实验的结果显示，HK受到的反馈抑制属于竞争性反馈抑制，其抑制程度随着底物L-高丝氨酸浓度的提高而降低。因此，解除该反馈抑制不能采用改变酶的蛋白结构的方法，需提高其底物L-高丝氨酸的浓度来缓解HK受到的反馈抑制[9]。

1.2.4 苏氨酸脱水酶

苏氨酸脱水酶（TD）由基因ilvA编码，是由4个完全一样的亚基组成的四聚体结构，能将L-苏氨酸催化为α-酮基丁酸，是L-异亮氨酸生物合成途经中的第一个限速酶，其酶活活性受到L-异亮氨酸的反馈抑制。研究人员常用临界致死浓度的α-氨基丁酸、L-异亮氨酸氧肟酸盐、邻甲基-L-苏氨酸及D-苏氨酸等结构类似物作为筛选压力获得优势突变株，其获得的抗性突变株能在基因水平上解除或减弱TD受到的反馈抑制[10]。

1.2.5 乙酰羟酸合酶

乙酰羟酸合酶（AHAS）由基因ilvBN编码，是L-异亮氨酸生物合成途经中的第二个限速酶，也是三个支链氨基酸合成过程中的第一个公共酶，其酶活活性主要受到来自L-缬氨酸的反馈抑制和三个支链氨基酸的反馈阻遏。AHAS是由大小两个亚基组成的，大亚基由基因ilvB编码，小亚基由基因ilvN编码，分别具备催化和调节功能。AHAS能够催化丙酮酸和来源于丙酮酸的活性乙醛生成α-乙酰乳酸，也能够催化α-酮基丁酸和活性乙醛生成α-乙酰羟基丁酸；此外，突变小亚基上的三个连续氨基酸能解除三个支链氨基酸对AHAS的反馈抑制[11]，如HOU X H等[12]利用基因工程技术将AHAS小亚基上的3个连续的氨基酸Gly-Ile-Ile定点突变为Asp-Asp-Phe，使得AHAS受到的反馈抑制被完全解除。此外，以临界致死浓度的α-氨基丁酸、2-噻唑丙氨酸等结构类似物作为筛选压力获取优势抗性突变株，也能在基因水平上解除或减弱AHAS受到的反馈调节。

2 L-异亮氨酸菌种选育现状

2.1 传统诱变育种

传统诱变育种方法主要采用各种诱变剂对出发菌株进行处理，以期望获得目标性状的突变株，常用的诱变剂有硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）、紫外线（ultraviolet，UV）以及近几年较流行的常温常压等离子体（atmospheric and temperature plasma，ARTP）等。传统诱变育种技术能在短时间形成大量的突变体，对实验技术、装备、环境没有过高要求且选育的高产菌株遗传性状较为稳定，在育种领域有着举足轻重的地位。但传统方法的效率较低、费时费力，主要是因为没有高效的筛选方法能快速筛选出优势菌株。随着研究者对微生物中氨基酸合成的反馈调节机制有了全面清晰的认识，开始利用氨基酸的结构类似物添加到筛选培养基中，能定向筛选反馈调节得到解除或弱化的突变株，获取目标遗传性能稳定的高产L-异亮氨酸突变菌株。如SHIIO I等[13]以黄色短杆菌为出发菌株，利用亚硝基胍进行逐级诱变，选育出具有抗α-氨基-β-羟基戊酸、邻甲基-L-苏氨酸等双重抗性突变株，在发酵66 h之后，L-异亮氨酸的产量达到14.5 g/L。YOSHINAGA F等[14]同样以黄色短杆菌为出发菌株，利用S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸、α-氨基-β-羟基戊酸、异硫氨酸等结构类似物为筛选压力，选育出具有多重抗性的优势突变株，通过补料流加醋酸铵与醋酸混合液来补充碳氮源，在发酵96 h后，使得L-异亮氨酸产量达到37.4 g/L。李进等[15]利用DES和60Co对栖糖蜜棒杆菌进行诱变处理，选育出具有抗磺胺胍、L-亮氨酸甲酯、α-氨基-β-羟基戊酸、乙硫氨酸等多重抗性以及能在琥珀酸为唯一碳源的筛选平板上快速生长的优势突变菌株，利用该优势突变株发酵72 h后，其产酸量达到15 g/L。谢飞等[16]利用低能氮离子束对谷氨酸棒杆菌进行多次诱变，选育出异亮氨酸氧肟酸抗性突变株，在50 L发酵罐上发酵培养51 h，使得产酸量达到32 g/L。王壮壮等[17]利用DES和ARTP对L-异亮氨酸生产菌黄色短杆菌I-12进行逐级诱变，选育出能抗2-噻唑丙氨酸、磺胺胍以及在琥珀酸为唯一碳源的筛选平板上能快速生长的优势突变菌株，在含有130 g/L葡萄糖的发酵培养基中发酵72 h后，其产酸量达到26.2 g/L。

传统诱变育种的方法简单、选育的菌株性状稳定，难点在于如何高效的筛选出优势菌株。目前，研究者常采用微孔板实现高通量筛选，获得优势菌株，如孔帅等[18]采用ARTP诱变处理谷氨酸棒杆菌，利用磺胺胍抗性标记结合多孔板筛选的方式，能快速的筛选出优势菌株，在摇瓶中发酵48 h，产量达到18 g/L，较出发菌株提高了62.03%。随着应用微液滴培养微生物技术的发展，微液滴培养结合特殊的检测技术如荧光检测，进行高通量培养及筛选，能在海量的突变菌株里面快速找到目标菌株。如吕彤等[19]通过ARTP诱变处理，在液滴微流控技术的基础上建立高通量筛选体系，将荧光蛋白融合入木聚糖酶便于荧光检测，经过筛选，在短时间内获得了木聚糖酶表达和分泌能力都得到提高的巴斯德毕赤酵母突变株，使得木聚糖酶活达到149.17 U/mg，较出发菌株提高了300%，分泌外源蛋白的能力相比出发菌株提高了160%。应用液滴微流控技术结合特异性的检测方法能够做到高效、低成本筛选出目标菌株。随着王森等[20]成功的将近红外光谱分析技术应用于监测L-异亮氨酸的发酵过程，在此后采用高通量筛选L-异亮氨酸高产突变株，利用微液滴培养结合近红外检测技术有望实现高效筛选目标菌株。

2.2 代谢工程育种

目前，L-异亮氨酸的工业生产菌株主要是由传统诱变育种的方法所得，因其遗传背景不够清晰，产酸量和糖酸转化率很难再进一步得到提高。利用代谢工程技术构建基因工程菌可以有效解决产酸量低和糖酸转化率低的问题。代谢工程育种技术主要是利用基因工程技术有目的改造宿主细胞的基因组，以期望获取目标产物得到提高的菌株的技术[21]。目前利用代谢工程技术对L-异亮氨酸生产菌株进行改造主要通过高效表达L-异亮氨酸合成路径中涉及到的关键酶的编码基因来提高其产量以及优化细胞膜的结构来增强L-异亮氨酸向胞外的分泌能力。

高效表达L-异亮氨酸的合成路径中涉及到的关键酶的控制基因，特别是高效表达抗反馈抑制的突变体基因，能有效地提高L-异亮氨酸的产量。如GUILLOUET S等[22]将带有HD、HT与TD编码基因的质粒PAPE20转化到苏氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）ATCC21799中并进行过表达，在4 L发酵罐中培养，使得L-异亮氨酸产量达到40 g/L。MORBACH S等[23]以赖氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）MH20-22B为出发菌株，将AK和HD的编码基因整合到谷氨酸棒杆菌MH20-22B的染色体上，并过表达TD基因，在摇瓶中产酸量达到6.6 g/L，进一步通过发酵罐补料实验使得产酸量达到18.1 g/L。YIN L H等[24]将具有抗反馈抑能力的TD和AHAS的编码基因转入L-异亮氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）JHI3-156中并进行过表达，在3 L发酵罐中发酵72 h，产酸量达30.7 g/L，较对照组提高了26%。MA W J等[25]为了提高还原型辅酶二的水平，将能强化HMP途径代谢流的反应酶6-磷酸葡萄糖酸转移酶、磷酸葡萄糖酸内酯酶和果糖二磷酸酯酶的编码基因在穿梭质粒上进行三酶过表达，将三酶共表达重组菌株在3 L发酵罐上发酵96 h后，L-异亮氨酸产量达到29 g/L，相比对照组提高了21%。

随着L-异亮氨酸的浓度在胞内不断累积，其由胞内向胞外转运的能力不能平衡胞内外L-异亮氨酸的浓度时，高浓度的胞内L-异亮氨酸积累会抑制合成路径中关键酶的酶活活性，影响L-异亮氨酸在胞外的累积，甚至会抑制细胞的生长。因此，优化L-异亮氨酸的转运系统有助于L-异亮氨酸产量的提升。XIE X等[26]将谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）YILW的输入蛋白基因BrnQ和输出蛋白基因BrnFE进行过量表达，来促进L-异亮氨酸向胞外的分泌，使得L-异亮氨酸的产量达到29.0 g/L，相比出发菌株提高了11.9%。YIN L等[27]在谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）JHI3-156中串联表达了全局调控因子（Lrp）和双组份分泌系统的编码基因（BrnFE），在重组菌发酵72 h后，L-异亮氨酸的产量达到26.8 g/L，相比发菌株提高了62.4%。李忠财等[28]在谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）LD320中过量表达突变型BrnFE1基因，重组菌在摇瓶中的产酸量为4.44 g/L，相比对照组提高21%。此外，为了进一步增加细胞膜的通透性，对发酵过程中的添加的吐温80的浓度进行了优化，在7 L发酵罐中发酵65 h后，其产酸量达到25.45 g/L，较出发菌株提高了37%。

3 L-异亮氨酸的发酵过程控制

L-异亮氨酸产量的提升不单需要生产菌自身具备有强大的产酸能力，其发酵过程的控制也同样重要。在分析了生产菌生理代谢特性的基础上，对发酵过程进行合理控制，有利于L-异亮氨酸产量的提高。在L-异亮氨酸发酵过程中，外源因素的影响主要有发酵培养基成分、代谢调节因子、温度、pH值、溶氧、细胞膜通透性的控制以及发酵控制策略等。

3.1 发酵培养基

生产菌的生长、繁殖以及L-异亮氨酸的生物合成所需的营养物质均来自于发胶培养基。因此，发酵培养基的组分及含量的配比能很大程度的影响到生产菌的生长以及产物的合成和积累。适宜的培养基成分和配比能使生产菌的生长发育和产物生物合成之间达到资源最佳利用分配，从而令资源更多的用于产物的合成，提高发酵的效率。

3.1.1 碳源、氮源

碳源主要为细胞提供自身的构成组分以及合成L-异亮氨酸的碳架和能量。在L-异亮氨酸的发酵生产中，一般以葡萄糖作为碳源。氮源的主要作用是为细胞体内含氮化合物的合成提供氮元素（如合成氨基酸、蛋白质以及核酸等）。氮源分为无机氮源和有机氮源。无机氮源的作用效果快，能被细胞迅速分解利用，一般用来满足微生物在生长前期的氮源需求。有机氮源中含有丰富的氨基酸、维生素和生长因子等营养物质，被细胞水解后才会发挥作用，水解过程缓慢，细胞对蛋白的利用速度也比较慢，主要有玉米浆、蛋白胨以及各种有机粉饼等[29]。玉米浆相对其他有机氮源比较廉价且营养成分较为丰富，被广泛应用于氨基酸的发酵工业中[30]。

3.1.2 无机盐

无机盐对细胞的组成、胞内各种酶的激活或抑制以及调节培养基的理化性质都有着重要意义（如磷酸盐、钙盐等）。磷酸盐控制着细菌体内脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）和蛋白质的合成以及糖代谢、细胞呼吸，还能以游离的磷酸基团形式参与腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）与二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）之间相互转化的反应，进而影响胞内ATP的水平[31]；钙离子通过增强丙酮酸羧化酶的活性来促进丙酮酸羧化[32]，有利于草酰乙酸的生成，增加L-异亮氨酸合成路径的碳通量。

3.1.3 维生素

生物素又称维生素H、维生素B7和辅酶R，在谷氨酸棒状杆菌体内的多个生长代谢反应中都起着重要作用，如丙酮酸的脱羧反应，合成吡啶、核苷酸、核酸，形成嘌呤核嘧啶的碱基以及合成脂肪酸、蛋白质等[33]。在L-异亮氨酸的生物合成中，生物素作为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的辅基，通过促进二氧化碳的固定能把碳流导向合成L-异亮氨酸的代谢途径，使其主代谢流碳通量变大，从而增大L-异亮氨酸的合成量[34]。维生素B1又称硫胺素，在菌体内磷酸化成为焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）参与到代谢中，TPP是丙酮酸脱氢酶系的辅助因子，能促进丙酮酸脱氢生成乙酰辅酶A进入TCA循环，有利于生成前体物草酰乙酸[35]。在培养基中添加合适浓度的硫胺素有利于L-异亮氨酸生产菌的生长以及产物的合成。通常有机氮源中含有大量的生物素和维生素B1，是培养基中生物素和维生素B1的重要来源，也可以单独添加。

3.1.4 发酵培养基优化

优化最佳发酵培养基通常采用单因素法得到最佳碳氮源、无机盐、维生素等，再利用正交试验法或响应面法对发酵培养基进行系统优化，得到最佳发酵培养基配方。陈宁等[36]考察了不同的碳源、氮源对L-异亮氨酸产量的影响，得到最佳碳源为葡萄糖、最佳氮源为硫酸铵，并利用响应面法分析得到发酵培养基的最佳配方，使得L-异亮氨酸产量达到23.36 g/L，相比优化前产量提高了22.52%。王壮壮等[17]以黄色短杆菌（B.flavum）TA-6为L-异亮氨酸生产菌，利用响应面法设计试验，得到最佳显著因素为葡萄糖、硫酸铵和磷酸二氢钾，并分析回归模型得到最佳发酵培养基配方，经验证，L-异亮氨酸的产量达到27.8 g/L，相比优化前产量提高了6.1%。

3.2 代谢调节因子

在L-异亮氨酸的发酵过程中，许多研究者通过在培养基中添加代谢调节因子来促进L-异亮氨酸的积累，如柠檬酸钠、胆碱或氯化胆碱、甜菜碱等。研究发现，在菌体发酵过程中添加适宜浓度的柠檬酸钠能有效降低EMP途径中关键酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活活性，令参与EMP过程中相关酶的活性降低，同时也能增加HMP途径的关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性[37]。如马雷等[38]以黄色短杆菌为L-异亮氨酸生产菌，在培养基中添加2 g/L的柠檬酸钠，使得的产酸量达到25.63 g/L，比对照组提高了7.87%。通过分析柠檬酸钠添加前后的代谢流量，发现在L-异亮氨酸发酵过程中添加适宜浓度的柠檬酸钠能降低EMP途径通量，增加HMP途径通量，生成更多的还原型辅酶二，使得L-异亮氨酸的产量得到提高。胆碱是一种有机碱，属B族维生素，能促进甲基合成、调节细胞内渗透压以及调节菌体脂肪代谢和蛋白质合成。在L-异亮氨酸的发酵过程中，能有效促进L-异亮氨酸甲基的合成、提高菌体内酶活活力、促进菌体的生长发育，从而提升L-异亮氨酸的产量。陈宁等[39]以黄色短杆菌为L-异亮氨酸生产菌株，通过添加1 g/L的胆碱于发酵培养基中，使得L-异亮氨酸的产量达到了40.5 g/L，与未添加胆碱相比产酸量提高了22%，糖酸转化率提高至18.4%。甜菜碱含有3个活性甲基，能高效的提供甲基给微生物利用，对促进氨基酸发酵中氨基酸的过量积累有明显的效果。潘崇德[40]以乳糖发酵短杆菌为生产菌株，在菌体生长延滞期添加10 g/L的甜菜碱，使得L-异亮氨酸的产量达到24.79 g/L，相比对照组提高了11.2%。综上，在发酵培养基中添加适宜浓度的代谢调节因子能有效的提高L-异亮氨酸的产量。

3.3 温度

菌体的生长和代谢产物的合成是在酶的催化作用下进行的，温度不仅是酶活力的最大影响因素，还能改变发酵液的物理性质以及细胞对营养物质的吸收利用速度，进而影响细胞的生长繁殖和目标产物的合成，因此，在L-异亮氨酸的发酵过程中控制好温度的变化非常重要。许正宏等[41]认为，在L-异亮氨酸发酵过程中采用变温控制的方法有利于终产物的积累，在发酵前期温度控制在31 ℃，此时的温度适合菌体的生长，使菌体能够快速进入产酸期，缩短菌体生长的时间。在发酵后期控制其温度在28 ℃，此时菌体内关于L-异亮氨酸合成的酶系活性较强，有利于L-异亮氨酸的生物合成。常高峰[42]以黄色短杆菌为L-异亮氨酸生产菌，采用变温控制的模式，在发酵前56 h将温度控制在31 ℃，后32 h温度控制在28 ℃，在该模式下最终产酸量达到21.36 g/L，相比采用28 ℃恒温发酵其产酸量提高了16.95%，较31 ℃恒温发酵其产酸量提高了5.8%。

3.4 pH

pH能直接影响L-异亮氨酸合成路径中相关酶的活性。当pH处于合适范围内，细胞中相关酶的活性会增强，菌体的生长将会更加旺盛，代谢产物的合成也会增加；pH还能通过影响培养基中营养物质和中间代谢产物的离解形式来影响细胞的正常代谢过程，进而左右代谢终产物的生成[43]。在L-异亮氨酸发酵过程中，常采用流加氨水或尿素来控制pH，同时还能补充无机氮源。流加用的氨水浓度一般采用14%、25%、28%，利用氨水调节pH值的作用效果迅速，不容易把握，而通过流加尿素的方法因其每次的流加量比较少，其维持pH值的效果比较稳定。有研究认为菌体生长的不同阶段维持不同的pH有利于L-异亮氨酸的积累，如常高峰[42]以黄色短杆菌为L-异亮氨酸生产菌，采用分阶段控制pH的方式，在0～48 h将pH控制在6.9～7.1，到48 h后将pH维持在7.15，发酵80 h后维持pH为7.25，使得L-异亮氨酸产量达到21.73 g/L，较对照组提高了6.5%。

3.5 溶氧

L-异亮氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，在发酵过程中对氧气的需求处于谷氨酸（一类发酵，氧气需求量大）和亮氨酸（三类发酵，氧气需求量小）之间[44]，究其原因，发现合成L-异亮氨酸的一部分碳架来源于丙酮酸，丙酮酸到L-异亮氨酸的合成要经过三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）和生成羟乙基焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，He-TPP）两个途径，TCA对氧气的需求较高，He-TPP途径对氧气的需求较低，因此，在发酵过程中控制好氧气的供给是提高L-异亮氨酸产量和生产强度的关键。张俊丽等[45]以乳糖发酵短杆菌为L-异亮氨酸生产菌株，在基于溶氧反馈控制模式下，将溶氧维持20%、30%、35%和40%，考察不同溶氧对L-异亮氨酸产量的影响，发现在溶氧气浓度维持20%时产酸量最高、生产强度最大。PENG Z J等[46]以乳糖发酵短杆菌为生产菌株，通过改变搅拌转速控制的两阶段控氧模式，即0～10 h搅拌转速为700 r/min，10～56 h搅拌转速为600 r/min，使得产酸量达到23.3 g/L，较之前搅拌转速优化结果最好的600 r/min的产量提高了11.6%。

3.6 细胞膜通透性的控制

在L-异亮氨酸的发酵过程中，产物从胞内分泌到胞外的过程是积累L-异亮氨酸的关键。L-异亮氨酸若能及时的从胞内转运到胞外，就能令胞内的L-异亮氨酸不能达到形成反馈调节的浓度，胞内的L-异亮氨酸就能不断优先合成，不断的分泌到细胞外，从而过量的积累L-异亮氨酸。L-异亮氨酸由胞内转移到胞外不仅可以通过强化转运蛋白的能力来实现，也可以通过控制细胞膜的通透性来增强其由胞内分泌到胞外的能力。细胞膜的通透性与磷脂和细胞壁的合成量有关，要想改变细胞膜通透性需从这两个方面入手。

控制磷脂的合成常采用在培养基中添加适宜浓度的生物素以及在发酵过程中添加表面活性剂的方法。生物素是脂肪酸生物合成中关键酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，通过影响脂肪酸的合成间接影响磷脂的合成。如熊海波等[47]以谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）YILM 1504为L-异亮氨酸生产菌，通过限制发酵培养基中生物素的浓度，从对数后期开始繁殖的菌体细胞膜通透性增强，使得L-异亮氨酸的产量达到42.5 g/L，相比利用高浓度的生物素发酵，其产酸量提高了93.18%。表面活性剂是生物素的拮抗物，在不饱和脂肪酸的合成中起到抑制作用，进而影响磷脂的合成。如龙辉[48]以谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum）YILM为L-异亮氨酸生产菌，在菌体培养至18 h，即对数末期，添加0.2%的表面活性剂吐温80，使得L-异亮氨酸产酸量达到26.43 g/L，相比对照组提高了10.63%。减少细胞壁的合成是通过在发酵的对数生长期早期，将青霉素等抗生素添加其中，使其抑制糖肽转肽酶的活性来影响细胞壁糖肽的生成，进而影响细胞膜的通透性。如陈行通[49]在L-谷氨酸的发酵过程中，在每毫升的发酵液中添加6个单位的青霉素，使得其平均产酸量达到64 g/L，相比未添加青霉素，其产酸量提高了18%。虽然添加抗生素法还未在L-异亮氨酸的生产中进行实践，但其可行性很高，可以尝试。

3.7 发酵策略

L-异亮氨酸的产量与菌体量是具有相关性的，要想过量的积累L-异亮氨酸，需兼具发酵前期生产菌株的生长和产酸期的发酵调控。就L-异亮氨酸的生产而言，菌体的生长和L-异亮氨酸的生成对营养物质、氧气、温度以及pH等外源因素的需求是不同的，因此，要基于生产菌自身的特性来制定合适的发酵策略，才能L-异亮氨酸得到高产。研究人员通常采用双阶段控氧[46]、控温[42]和控制pH[42]的模式使得菌体能处于最适生长和产酸条件，达到提高产酸量的目的；或在菌体到达产酸期时流加葡萄糖的方式，延长发酵周期来提高产酸量。因此，良好的发酵控制策略能有效的提高L-异亮氨酸的产量。如张成林等[50]以谷氨酸棒杆菌为生产菌，采用在产酸期指数流加玉米浆、磷酸盐结合双阶段控制溶氧的发酵策略生产L-异亮氨酸，使得产酸量达到了31.32 g/L，较对照组提高了20.97%。

4 展望

优良菌种的选育依然是高产L-异亮氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于我们找到未知性状的高产L-异亮氨酸突变株，建立新的代谢网络。利用基因工程技术反向分析造成未知性状突变株高产L-异亮氨酸的原因，进而通过理性设计，在分子水平改造遗传物质，有助于得到糖酸转化率进一步提高的优势菌种。在发酵过程中，良好的监测设备和传感器有助于对发酵过程进行实时监控，检测产物、副产物的生成情况，以便及时调整发酵控制过程，增加终产物L-异亮氨酸的产量，减少有机酸、其他氨基酸的生成。目前，高通量的培养及筛选技术还不成熟，使得未知性状的高产L-异亮氨酸突变株的寻找成为难点，随着新型筛选设备、发酵设备的研发，将有助打破瓶颈，使L-异亮氨酸的生产迈上一步台阶。