恶臭假单胞菌降解光氧化褐煤工艺条件优化

李建涛，刘向荣，徐 杰，庄肃凯

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000；2.西安科技大学化学与化工学院， 陕西 西安 710054；3.陕西省尾矿综合利用重点实验室，陕西 商洛 726000)

我国是煤炭大国，探明储量位居世界第三，其中褐煤已探明保有储量达1 303亿t，占全国煤炭储量近13%[1]。褐煤由于水分、灰分和挥发分含量高，热值低，氮、硫及重金属含量高，直接燃烧热效率低，污染极大，故对褐煤进行清洁高效利用势在必行[2-3]。煤的微生物降解在低阶煤的清洁高效利用方面具有广阔的发展前景，经过近40年的发展，煤的微生物降解技术取得了一定的成果，但也存在很多难题，其中最主要的问题是微生物对煤的降解率低及高效降解菌株缺乏普适性[4-5]。鉴于此，作者筛选降解光氧化褐煤的优势菌株，并通过单因素实验优化优势菌株降解光氧化内蒙古胜利褐煤的工艺条件，为低阶煤的分级降解方法的建立提供数据支持。

1 实验

1.1 煤样与仪器

内蒙古胜利褐煤(SLH)、云南昭通褐煤(ZTH)、山西浑源褐煤(HYH)、内蒙古元宝山褐煤(YBH)，经前处理得到粒度均为(-0.15+0.075) mm 的煤样。

旋转SW-CJ-1FD型单人单面超净工作台，苏州净化设备有限公司；BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HZQ-F100型恒温振荡培养箱，太仓豪诚实验仪器制造有限公司；BC-360型生化培养箱，苏州威尔实验用品有限公司；TU-1900型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；XMB-70A型棒磨机，武汉探矿机械厂；CTDG-200875型密封对辊破碎机，徐州威科科技有限公司；F2KA56960型超纯水仪，美国Millpore公司。

1.2 菌株与培养基

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PSA)、黄杆菌(Flavobacteriumsp.，FLS)，中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，BAS)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa，PAP)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida，PSP)、金色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，STA)，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH值7.4～7.6。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上加琼脂15 g。

1.3 褐煤的光氧化预处理

采用旋转床光化学反应器[6]对褐煤进行光氧化预处理，预处理条件[7]为：煤加量20 g、煤样粒度(-0.15+0.075) mm、紫外光强度150 W、马达转速120 r·min-1、氧化时间42 h、通氧时间40 min。分别得到光氧化内蒙古胜利褐煤(GSLH)、光氧化云南昭通褐煤(GZTH)、光氧化山西浑源褐煤(GHYH)和光氧化内蒙古元宝山褐煤(GYBH)。

1.4 菌株的活化及复壮

将4 ℃斜面保藏的菌株PSA、FLS、BAS、PAP、PSP和STA分别接种至装有10 mL LB液体培养基的试管中，于30 ℃、振荡频率160 r·min-1的培养箱中培养2 d。在预先倒好的LB固体培养基平板上分别划线，于30 ℃、相对湿度80%的人工气候培养箱中培养2 d；观察无杂菌后，用接种针挑取少量菌体放入50 mL无菌水中充分振荡，接种环蘸取一孔接种于装有10 mL LB液体培养基的试管中，于30 ℃、振荡频率160 r·min-1的培养箱中培养2 d；用接种环蘸取一孔接种至装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中，于30 ℃、振荡频率160 r·min-1的培养箱中培养2 d，得6种菌液作为种子液。

1.5 降解光氧化褐煤的优势菌株的筛选

取试管若干，每个试管装LB液体培养基20 mL。除无菌空白对照(BC)以外的试管，分别用接种环蘸取复壮好的6种菌液一孔逐个接种，置于恒温振荡培养箱中，于30 ℃、160 r·min-1下振荡培养2 d，培养基变浑浊，分别加入粒度为(-0.15+0.075) mm的光氧化褐煤(0.2±0.0002) g，继续振荡培养20 d，设3组平行实验。培养结束后，降解液于10 000 r·min-1离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，以去离子水为参比，测定450 nm处吸光度(A450)，以3组平行实验的A450平均值为指标来评价降解效果[8-10]。A450值最大者为降解光氧化褐煤优势菌株，用于后续实验。

1.6 单因素实验

采用单因素实验，在煤样粒度为(-0.15+0.075) mm、液体培养基为20 mL、降解温度为30 ℃的条件下，考察煤加量(0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g)、接种量(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL)、培养箱振荡频率(60 r·min-1、110 r·min-1、160 r·min-1、210 r·min-1、260 r·min-1)、降解时间(6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d)对GSLH降解效果的影响。培养结束后，降解液于10 000 r·min-1离心15 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，以去离子水为参比，测定450 nm处的吸光度(A450)，以3组平行实验的A450平均值为指标来评价降解效果。A450值越大，表明降解效果越好。

2 结果与讨论

2.1 降解光氧化褐煤的优势菌株的筛选

6种细菌对光氧化褐煤的降解效果见图1。

由图1可知，6种细菌对4种光氧化褐煤均有不同程度的降解，对GSLH的降解能力强弱顺序为PSP>PSA>PAP>FLS>BAS>STA，对GZTH的降解能力强弱顺序为PSP>PSA>PAP>BAS>FLS>STA，对GHYH的降解能力强弱顺序为PSP>PSA>STA>PAP>BAS>FLS，对GYBH的降解能力强弱顺序为PSP>PSA>PAP>BAS>FLS>STA。通过比较，6种细菌中，降解4种光氧化褐煤能力最强的均为PSP。因此，确定PSP为降解光氧化褐煤的优势菌株，其形貌见图2。

图1 6种细菌对光氧化褐煤的降解效果Fig.1 Degradation effect of 6 bacteria on photooxidized lignite

图2 恶臭假单胞菌中的固体培养(a)和液体培养(b)形貌Fig.2 Morphology of Pseudomonas putida in solid medium(a) and liquid medium(b)

2.2 单因素实验结果

2.2.1 煤加量对降解液吸光度的影响(图3)

图3 煤加量对降解液吸光度的影响Fig.3 Effect of lignite dosage on absorbance of degradation liquid

由图3可知，随着煤加量的增加，降解液的A450值先增大后减小，当煤加量为0.3 g·(20 mL)-1时，A450值达到最大，为5.052；继续增加煤加量，A450值急剧下降。故最佳煤加量为0.3 g·(20 mL)-1。

2.2.2 接种量对降解液吸光度的影响(图4)

图4 接种量对降解液吸光度的影响Fig.4 Effect of inoculation size on absorbance of degradation liquid

由图4可知，随着接种量的增加，降解液的A450值迅速增大，当接种量达到2.0 mL·(20 mL)-1时，降解液的A450值达到5.234；继续增加接种量，A450值变化不大。故最佳接种量为2.0 mL·(20 mL)-1。

2.2.3 培养箱振荡频率对降解液吸光度的影响(图5)

图5 培养箱振荡频率对降解液吸光度的影响Fig.5 Effect of incubator oscillation frequency on absorbance of degradation liquid

由图5可知，随着培养箱振荡频率的增大，降解液的A450值先增大后减小，当培养箱振荡频率为210 r·min-1时，A450值达到最大，为5.395。当培养箱振荡频率为160 r·min-1时，降解液的A450值为5.357，与培养箱振荡频率为210 r·min-1时差别不大，考虑到节能，故最佳培养箱振荡频率为160 r·min-1。

2.2.4 降解时间对降解液吸光度的影响(图6)

由图6可知，随着降解时间的延长，降解液的A450值逐渐增大，当降解时间达到12 d时，降解液的A450

图6 降解时间对降解液吸光度的影响Fig.6 Effect of degradation time on absorbance of degradation liquid

值为5.252；继续延长降解时间，降解液的A450值变化不大。故最佳降解时间为12 d。

3 结论

从6种细菌中筛选出降解光氧化褐煤的优势菌株为恶臭假单胞菌，并通过单因素实验优化了恶臭假单胞菌降解光氧化内蒙古胜利褐煤的工艺条件。确定恶臭假单胞菌降解光氧化内蒙古胜利褐煤的最佳工艺条件为：煤加量0.3 g·(20 mL)-1、接种量2.0 mL·(20 mL)-1、培养箱振荡频率160 r·min-1、降解时间12 d、煤样粒度(-0.15+0.075) mm、降解温度30 ℃。