辣根过氧化物酶催化2-萘酚硝化反应

夏志童 臧 硕 陆洪珅 闫福鹏 李延辉 赵 莹

山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院，山东 泰安 271016

辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)是从植物辣根菜中提取出来的一种性质稳定、成本较低的酶[1-2]，由于对过氧化氢底物特异性强，因此作为一种重要的分析化学试剂广泛用于有机合成、生物转化、临床化学、环境化学等领域，但是过氧化物酶应用在硝化领域还只是在实验摸索阶段[3-7]。为了研究辣根过氧化物酶催化2-萘酚硝化反应，本实验采用了水-有机相双相反应体系，用绿色氧化剂H2O2氧化、辣根过氧化物酶催化硝化2-萘酚，考察了关键实验参数对产物产率的影响规律，并对主要产物进行了分离及鉴定，完成了2-萘酚在辣根过氧化物酶下的催化硝化反应的实验研究，同时为1-硝基2-萘酚的绿色合成提供了一种新方法。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1仪器设备

P230Ⅱ型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)，IRTracer-100傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津)，SZCL-2A数显智能控温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，HH-2双孔数显恒温搅拌水浴锅(金坛市城东新瑞仪器厂)，AR224CN分析天平(奥豪斯仪器有限公司)，KQ3200E超声仪(昆山市超声仪有限公司)，X-5显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)，移液枪(兰博利德公司)，微量进样器(无锡市东升玻璃仪器厂)，硅胶板G(青岛海洋化工有限公司)，广泛试纸pH 1-14(天津北方化学试剂厂)，DH-101鼓风干燥箱(上海硕光电子科技有限公司)。

1.1.2试剂

辣根过氧化物酶(300 U/mg，购自北京梦怡美生物技术有限公司)，乙萘酚(分析纯，洛阳特来化工科技有限公司)，磷酸氢二钠(分析纯，苏州市万事发化工有限公司)，磷酸二氢钠(分析纯，苏州市万事发化工有限公司)，亚硝酸钠(优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，过氧化氢(30%，莱阳市康德化工有限公司)，薄层及柱层析用硅胶(青岛市基意达硅胶试剂厂)，甲醇(色谱纯，上海广诺化学科技有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，上海广诺化学科技有限公司)，石油醚：沸程60～90℃(分析纯，天津欧博凯化工有限公司)，纯净水(娃哈哈有限公司)。

1.2 方法

1.2.1主要溶液的配制

辣根过氧化物酶的配制：取一定量HRP用磷酸缓冲液配制成0.1 mg/mL备用。

乙萘酚溶液的配制：精密称取25.4 mg的乙萘酚，用20 mL乙酸乙酯配制成5 mmol/L的溶液备用。

亚硝酸钠溶液的配制(底物浓度的10倍)：精密称取103.5 mg的NaNO2，用30 mL缓冲溶液配制成50 mmol/L的溶液备用。

1.2.2辣根或氧化物酶的催化硝化反应

50 mL的反应体系，在室温下取25.8 mL的亚硝酸钠溶液、20 mL乙萘酚溶液，加入磁子，置于磁力搅拌器搅拌混溶，快速加入2.5 mL HRP溶液继续搅拌，取1.7 mL H2O2多次少量滴加，反应1 h。

反应结束后，将混合溶液置于分液漏斗中，用乙酸乙酯多次萃取，取上层有机相，常温自然挥干得粗提物。

1.2.3硝化产物的分离及纯化

利用硅胶柱层析法，石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，分别收集流份，用硅胶G板检测，合并相同流份，常温放置析晶。

1.2.4主要条件对产物产率的影响

分别通过控制时间、NaNO2的量、温度、pH值等不同条件，对得到的产物进行含量测定。在高效液相色谱中，根据面积归一化法，确定主要硝化产物的产率。

液相色谱分析条件：P230Ⅱ型高效液相色谱仪，检测器：UV230Ⅱ，检测波长：254 nm，色谱柱：Kromasil 100-5 C18column(250×4.6 mm，Sigma-Aldrich)，流动相：水-甲醇(25∶75)，进样量：10 μL，流速1.0 mL/min，室温[8]。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定结果

主要硝基产物为1-硝基-2-萘酚，黄色结晶。测得其熔点为103.5～104.3℃。ESI-MSm/z：190.05 [M+H]+。产物IR谱νmax(KBr压片，cm-1):1620、1508、1428、1530、1340、842、735，与文献上的相同[9]。

2.2 亚硝酸钠量对硝化反应的影响

亚硝酸钠在本次实验研究中作为硝化反应的硝化剂，为了解硝化剂量对硝化产物的影响，分别以硝化剂量为乙萘酚量的2、5、10、20、50倍考察对硝化产物的影响，结果见表1。

表1 亚硝酸钠用量对硝化产物的影响

从表1中可明显看出，随亚硝酸钠浓度的不断提高，硝化产物的量也不断增长，当亚硝酸钠的浓度高于100 mM，即底物量的20倍以上时，产物的量不再明显增加。从整体来看，亚硝酸的过量并不会对反应产生太大的影响。所以，为了节约硝化剂，亚硝酸钠的浓度应控制在底物浓度的20倍左右。

2.3 时间对硝化反应的影响

时间作为一个在硝化反应中影响产率的重要因素，分别研究反应时间为0.2、0.5、1、2、5 h硝基产物的产率。

由表2可明显看到，随着时间的延长，硝基产物的产率增加，但1 h后产物的产率增加不明显，趋近平稳，说明该反应在开始1 h后基本结束。导致反应结束的原因有很多，可能是有机试剂引起酶的失活，也可能是反应物的浓度不足等引起，原因还有待进一步研究。综合考虑，反应时间控制到1 h。

表2 时间对硝化产物的影响

2.4 温度对硝化反应的影响

温度会影响酶的结构及底物和产物的溶解性，是影响酶催化反应的重要条件，分别观察4℃、20℃、35℃、50℃、80℃硝基产物的产率。

根据表3可以看出，反应温度在20℃时，产率较高，酶相对稳定；当温度高于50℃时，产率下降很快，说明高温影响了HRP的稳定性和活性。为了节约能源，将反应温度定为20℃或室温。

表3 温度对硝化产物的影响

2.5 pH对硝化反应的影响

pH会影响酶的结构、稳定性和活性，同样是影响酶催化反应的重要条件，分别观察pH值为5、6、7、8、9时硝基产物的产率。

根据表4可以看出，过酸过碱均会影响产率，pH值等于7时，生成产物的浓度最大，所以确定最适pH值为7。

表4 pH对硝化产物的影响

3 讨 论

辣根过氧化物酶在亚硝酸钠、过氧化氢体系中能与乙萘酚发生催化硝化产物，主要的产物是单硝基产物1-硝基-2-萘酚。反应条件对催化活性和产物产率影响较大，由于酶的失活和H2O2的消耗，导致反应产率较低，可通过后续少量多次补加酶和H2O2来提高产率[10]。亚硝酸钠的量∶底物的量 = 20∶1，反应温度20℃，反应时间为1 h，硝化产率25.5%。本实验为实现硝基萘酚的绿色合成提供了一种新的方法。