慢性间歇低氧大鼠模型骨髓中基质金属蛋白酶-9及微血管增生的变化*

朱明明, 杨敏, 刘文玲, 冀林华, 格日力, 李占全△, 崔森△

1青海大学附属医院血液科(青海西宁 810001)； 2青海高原医学研究中心(青海西宁 810001)

低氧是高原地区最主要的影响因素，对机体包括对心血管系统、神经系统、消化系统等造成多方面的影响，同时伴随多系统微血管的增生和损伤[1-3]。以往研究表明慢性高原病机体组织发生微血管增生[4]。因此，我们推测，在慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)时，机体极有可能发生微血管增生，由于其病理机制的复杂性，至今尚未完全阐明。近年来，大量研究指出在多种缺血缺氧性疾病中，如脑梗死、脑卒中、病毒感染、急性肺损伤等，基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)高表达与微血管增生密切相关。MMP-9能够特异地水解细胞外基质和基底膜的化学成分Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原和粘连蛋白等，在正常生理情况下，能够切断细胞外基质成分，调节细胞黏着、直接或间接参与胚胎发育、组织重塑、创伤愈合和血管增生等生理学过程，与多种系统疾病相关，例如脑出血、脑缺氧、脑缺血和缺血再灌注，甚至在新生儿缺氧缺血性脑损伤时表达亦有所增加[5-14]，但目前在慢性间歇低氧诱导微血管增生的研究甚少，国内尚未见相关报道。为此，2018年12月至2019年6月，我们建立慢性间歇低氧大鼠模型，探讨骨髓组织中MMP-9的表达水平变化，观察病理组织中微血管的增生，为进一步阐明慢性间歇低压低氧微血管改变机制积累资料，并为拓宽相关疾病治疗研究思路提供线索。

1 材料与方法

1.1 动物 选取36只SPF 级雄性Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(鼠龄：7周左右，体重200～210 g)，分组为：常氧组(n=9)、缺氧7d组(n=9)组、缺氧14d组(n=9)、缺氧28d组(n=9)。由西安交通大学实验动物中心提供，大鼠被饲养在标准的鼠笼中，自由进水进食。制备缺氧组大鼠模型：将缺氧7d组、缺氧14d组、缺氧28d组大鼠在低压氧舱(青海大学高原医学中心)内饲养，模拟条件：模拟海拔高度5 000 m，氧分压11.3～11.4 kPa，温度26～28℃，湿度38%～56%，8 h/d，其余时间在正常情况下饲养，同一时间点分别连续处理 7、14、28 d，制作缺氧组模型。

常氧组大鼠饲养于高原医学中心动物房内，模拟条件：海拔2 261 m，温度20～25℃，通风良好，定期消毒。

1.2 主要试剂 Anti-MMP-9 (antibody catalog # ab38898)，提取RNA试剂盒QIAGEN miRNeasy Mini Kit (catalog # 217004)，反转录试剂盒Takara PrimeScript RT reagent kit(catalog #RR036A),定量试剂盒Takara TB Green Premix Ex Taq (catalog #RR820A),MMP-9和GAPDH引物(南京金斯瑞公司)，免疫组化试剂盒(中杉金桥)，兽用全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 测静脉血血常规 给予2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，抽取腹主静脉血5 mL，上机检测。

1.3.2 RT-PCR 测定MMP-9 mRNA 表达水平 麻醉大鼠，取分离、剪断股骨，用1×PBS冲洗骨髓组织于15 mL离心管中，4℃ 离心(3 000 r/min)5 min，300目滤网过滤，重复3次，留取沉淀，保存于-80℃冰箱中。吸柱法提取总RNA，逆转录、荧光定量，具体操作按照试剂盒详细说明进行。MMP-9引物序列为(forward:5′-GCATCTGTATGGTCGTGGCT-3′；reverse:5′-TGCAGTGGGACACATAGTGG-3′)，GAPDH(forward:5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，reverse:5′-GAACTTGCCGTGGGTAGAGT-3′).

1.3.3 免疫组化观察微血管密度(MVD) 麻醉大鼠，取分离、剪断股骨置于4%多聚甲醛中固定，经过脱钙、脱水、浸蜡、包埋，切片(厚度5 μm)。(1)抗原修复：切片放于枸橼酸缓冲液，微波炉高温加热修复，待自然冷却后，双蒸水冲洗2次，7 min/次。(2)阻断内源性过氧化物酶：3%H2O2的 PBS 溶液室温孵育30 min，PBS冲洗3次，6 min/次。(3)血清封闭，室温孵育1 h。(4)滴加MMP-9抗体，1∶600；室温孵育30 min，4℃过夜，冲洗3次，6 min/次。(5) 酶标山羊二抗IgG聚合体，室温孵育2 h，PBS缓冲液冲洗3次，6 min/次。(6)辣椒根素30 min，冲洗3次，6 min/次。(7)显色：DAB 室温下显色，显微镜下控制显色的时间(5 min左右)，当镜下出现棕黄色颗粒后，自来水冲洗 10 min，用苏木精复染。(8)经过乙醇梯度脱水和二甲苯透明后，中性树胶封片。在显微镜下放大倍数(20×10)，拍照，进行双盲法统计分析。由两位病理人员进行，每组随机选取5只大鼠，每只大鼠免疫组化10张片子，每张片子选取5个视野，进行微血管计数，最后进行统计学分析。

2 结果

2.1 血常规 缺氧组与常氧组比较，RBC、Hb及Hct差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧7d组、缺氧14d组、缺氧28d组大鼠的RBC、Hb、Hct水平均高于常氧组(P<0.05);随着缺氧时间的延长，RBC、Hb、Hct水平逐渐升高(P<0.05)。见表1。

表1 不同缺氧时间下大鼠血常规结果

2.2 RT-PCR结果 缺氧组大鼠骨髓MMP-9表达量与常氧组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；随着缺氧时间延长其水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 MMP-9 mRNA表达水平

注：*与常氧组比较P<0.05；△与缺氧7d组比较P<0.05;▲与缺氧14d组比较P<0.05图1 MMP-9 mRNA表达水平

2.3 免疫组化染色法结果 缺氧组大鼠骨髓MVD与常氧组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，随着缺氧时间的延长，其水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、3及表3。

表3 各组骨髓MVD变化

注：*与常氧组比较P<0.05；△与缺氧7d组比较P<0.05;▲与缺氧14d组比较P<0.05图2 骨髓MVD变化

注：A:常氧组；B:缺氧7d组;C:缺氧14d组;D:缺氧28d组;箭头所指为微血管，棕色环形结构表示MMP-9阳性的微血管图3 标记的微血管(×400)

3 讨论

长期缺氧引起机体全红细胞过度生成，血容量绝对增加、红细胞变形性下降，使得血液黏滞度增加、血流阻力增大、微循环障碍；这种血液高凝状态进而加重各脏器缺血缺氧状态，此外，缺血缺氧会导致引发骨髓的血管病理变化，如血液黏度增加和血管生成导致微血管增生，以代偿供氧[4]。高原低氧人群的“多血质面容”，为微血管增生的典型特征。我们的研究发现，大鼠在慢性间歇低氧条件下，红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容随着低氧时间延长，逐渐增加，这也是引起血液黏稠、血流减慢的主要原因，进而进一步加重缺氧，导致单纯性缺氧-继发性缺氧的恶性循环，最终刺激机体发生微血管增生以缓解机体缺血缺氧的状态。

此外，在本实验中，慢性间歇低氧条件下，与常氧组相比，缺氧7d组、缺氧14d组、缺氧28d组大鼠骨髓MVD均明显增加，并且缺氧28d组大鼠骨髓MVD明显高于缺氧14d组。随着慢性间歇低氧时间延长，大鼠骨髓微血管增生增加。我们分析其原因，主要是高原地区的典型特点是缺氧，在慢性缺氧过程中，机体多系统、多脏器发生一系列病理变化，其中重要变化是红细胞增多，血液黏滞度增加，血流减慢，造成组织脏器缺血缺氧，机体为代偿供氧，引起微血管的增生，其研究结果进一步论证了该观点。

慢性间歇低氧即不同程度的缺氧，类似于缺血/缺氧损伤可引起多器官损伤，在慢性间歇性低氧过程中，低氧可升高氧化应激生物标志物水平，氧化应激与炎症之间存在复杂关系，其以不同方式促进炎症反应发生，而随后的炎症状态和可激活多通路多蛋白的调控表达，包括MMP-9等蛋白[15-16]，进一步调控机体缺血缺氧损伤。

已有研究报道指出，MMP-9作为基质金属蛋白酶家族中较为重要的成员之一，主要功能是促进血管生成，在肿瘤疾病、脑梗死、脑缺血等缺血缺氧性疾病中研究甚多，参与微血管生成。在该实验中，缺氧7d组、缺氧14d组、缺氧28d组大鼠骨髓MMP-9表达明显高于常氧组，其中缺氧28d组大鼠骨髓MMP-9明显高于缺氧14d组，缺氧14d组大鼠骨髓MMP-9明显高于缺氧7d组。随着低氧时间延长，MMP-9表达逐渐增多。高表达的MMP-9在骨髓中标记微血管后，出现MMP-9阳性的微血管数目也相应增多，此外，MMP-9的主要功能之一是促进血管生成，且与微血管增生的变化一致，因此，我们推测，慢性间歇低氧条件下，大鼠骨髓微血管增生MMP-9的高表达密切相关。

既往有研究[17-18]指出，大鼠体内MMP-9的含量与微血管增生的发生以及发展是存在密切联系的，其作用的机制可能是在低氧条件下，机体发生氧化应激，促进炎性因子产生，激活多条通路，如IL-6-JAK2-STAT3-MMP-9引起机体组织血管内皮细胞分泌MMP-9，导致微血管增生。因此，在慢性间歇低氧条件下，大鼠骨髓组织中的MMP-9高表达与微血管的增生密切相关。

综上所述，本研究显示，慢性间歇低氧可导致大鼠骨髓微血管增生及骨髓组织中MMP-9表达量升高，并且MMP-9的高表达参与微血管的生成。关于低氧引起MMP-9高表达的具体机制待进一步研究。