84消毒溶液对生物实验室废弃细胞杀灭作用

吉新华，沈西华，邹 泓

（石河子大学 医学院病理学系，第一附属医院病理科，新疆 石河子 832000）

细胞实验是现代生物实验中一个重要组成部分，培养条件要求比较苛刻，在进行细胞实验时面临的 2个常见问题是细胞灭活和细胞污染。目前，国内大多数实验室对于细胞实验中废弃细胞的处理大都是直接排放进下水道，容易造成环境污染，对周围人群的健康造成潜在威胁，且国内未见用于活细胞灭活的市售制剂以及相关实验和方法的报道。其次大部分实验室的消毒仍然使用75%酒精、新洁尔灭、甲醛熏蒸等，尤其是超净台的消毒方法大多为擦拭75%酒精后用紫外线照射30 min。但是由于某些细胞的生命力较强，仍然存在消毒不彻底导致实验细胞的交叉污染，引起细胞的变异并影响实验结果[1]，因此有必要探讨新型生物实验室废弃细胞灭活方法，进而改良目前细胞实验室消毒流程。84消毒液主要用于各种物体表面和环境等的消毒[2]，是一种含氯消毒剂，其作用机制是通过细胞壁对细菌芽胞、甲乙肝病毒等多种病毒[3]、副溶血性弧菌[4]、结核分枝杆菌[5]进行杀灭作用。本实验拟通过细胞增殖研究梯度浓度的 84溶液对不同肿瘤细胞的杀伤作用，提出一种新型、廉价有效的生物实验室废弃细胞的灭活方法，并针对现有细胞实验室消毒方法进行改良，更好地减少生物实验室的污染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和耗材

1640（GIBCO中国）、DMEM（GIBCO中国）、胰蛋白酶含0.25% EDTA消化液（北京索莱宝公司）；PBS（上海生工公司）；胎牛血清（以色列Bidnd公司），15 mL 离心管（美国 Corning公司）；1 000、200、10 uL枪头（麦斯诺品牌）；96孔板（江苏海狸）；CCK8试剂（日本同仁）；25 cm2培养瓶；无粉乳胶手套（Biosharp公司）；青霉素链霉素的混合液（北京索莱宝公司）；1.5、2、5 mL EP管（南通海之星实验器材公司）。

1.1.2 主要仪器设备

Cu-420型电热恒温水箱（上海一恒科技有限公司），371型CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司），SW-CJ-1F型超净工作台（中国上海博讯公司），1 mL、200 uL、10 uL 移液器（德国 Eppendorf公司），TDL-50B型离心机（上海安亭科学仪器厂），LX-100手掌型离心机（江苏其林贝尔仪器制造有限公司），xMark酶标仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

待细胞复苏后从37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中取出待处理的细胞，放置在荧光倒置显微镜下观察，当细胞生长成致密单层，融合度基本达到80%～90%且状态良好时，用胰蛋白酶将细胞消化之后，进行铺板及其他后续实验。

1.2.2 细胞增殖实验

将融合度基本达到80%～90%且状态良好的786-0细胞株，用胰蛋白酶将细胞消化之后进行铺板。铺96孔板分为10组，每组铺5个复孔以去掉最大值和最小值，每个复孔铺1×104个细胞。然后将细胞放于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱培养24 h后，将各组的细胞的培养基换成含有梯度浓度的84消毒液的水溶液（表1）后，放入培养箱反应1和5 min后在每个复孔加入10 uL的CCK-8反应1 h后再检测其增殖情况。且后期通过在肾癌细胞系(ACHN)、食管癌细胞（109、9706）、滑膜肉瘤细胞（SW982）、横纹肌肉瘤癌细胞株（RD）、卵巢癌细胞株（A2980）中进行CCK-8实验以此确定不同 84消毒剂杀灭细胞的最佳浓度以验证之前的实验结果。

1.2.3 细胞成像

在786-0细胞株融合度基本达到80%～90%且状态良好时，将细胞用胰蛋白酶消化之后进行铺板。铺12孔板分为10组，每组铺1个复孔，每个复孔铺2×105个细胞。然后将细胞放于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱培养24 h后观察各组细胞的形态及拍照。待拍完照之后，将各组细胞的培养基换成含有梯度浓度的84消毒液的水溶液（表1），放入培养箱反应1 min后再观察各实验组细胞的形态并拍照。

表1 灭活液中84原液与水的配比

1.2.4 应用

SPSS2.0统计软件进行t检验，P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖实验

与对照组相比，随着 84水溶液浓度的增加对细胞的抑制率逐渐增加直到平台期，且由抑制曲线可以看出反应1 min时，84水溶液浓度为100 mg/L时处于平台期，对细胞抑制率最高；反应5 min时，84水溶液浓度为60 mg/L时细胞处于平台期（图1），对细胞的抑制效率最高（P＜ 0.05）。

2.2 细胞成像

反应1 min后，84消毒液处理组与对照组相比，细胞密度变小，形态发生改变，随着84消毒剂浓度的递增，细胞数量及形态发生更为明显的变化，直至84消毒剂浓度为 100 mg/L的处理组里面细胞的形态发生完全崩解（图2）；反应5 min后，84消毒液处理组与对照组相比，细胞密度变小，形态发生改变，随着84消毒剂浓度的递增，细胞数量及形态发生更为明显的变化，直至84消毒剂浓度为60 mg/L的处理组里面细胞的形态发生完全崩解（图3）。

2.3 84消毒剂对其他肿瘤细胞的影响

通过肾癌细胞(ACHN)、食管癌细胞（109、9706）、滑膜肉瘤细胞（SW982）、横纹肌肉瘤癌细胞株（RD）、卵巢癌细胞株（A2980）在 1 min反应时间内，确定84消毒剂的水溶液最佳杀灭细胞浓度为100 mg/L，P＜ 0.05（图 4）。

2.4 实验结果

实验结果显示，作用1 min后，84消毒液对肿瘤细胞杀伤力最佳浓度为100 mg/L；作用5 min后，84消毒液对肿瘤细胞杀伤力最佳浓度为 60 mg/L。为了更迅速、更有效达到杀灭细胞的目的，本文推荐浓度为100 mg/L 84消毒液短时间用于细胞室超净台的消毒和废弃细胞处理，即消毒剂84消毒剂：水为1∶499，反应1 min。此方法可以作为一种细胞室消毒方法，特别是超净台与细胞培养箱的消毒（消毒超净台顺序可为100 mg/L的84消毒剂、75%酒精和紫外照射 30 min）和废弃细胞的处理，应用于日常实验。

图1 肾透明细胞癌细胞株786-0加入梯度浓度的84消毒剂在反应1、5 min后的抑制率，其中A、B分别显示的是加入梯度有效氯含量的84消毒溶液后反应1、5 min后的抑制率

图2 梯度浓度的84消毒液作用1 min后对肾透明细胞癌细胞株（786-0）细胞形态的影响（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分别是加入有效氯为 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的细胞形态；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分别是加入有效氯为0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的细胞形态

图3 肾透明细胞癌细胞株（786-0）反应5 min前后细胞形态变化。其中（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分别是加入有效氯为 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的细胞形态；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分别是加入有效氯为0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的细胞形态

图4 梯度有效氯浓度的84消毒溶液反应1 min对不同肿瘤细胞的影响

3 结论

现代医学实验室管理存在的主要问题是没有采用正确的方法处理废弃物，实验结束后直接将废弃物倒入下水道[6]。对于这些细胞实验过程中产生的生物活性材料及其代谢物，比如培养的细胞、微生物及其培养物等[7]，如不加以妥善处置，必然对环境和人类健康产生很大危害[8]。

本实验确定了平时最常见的消毒剂（84消毒剂）在1 min内最佳的杀灭细胞的浓度为100 mg/L，来杀灭细胞实验在操作过程中遗留在细胞间尤其是超净台和无菌室的细胞，从而减少细胞间的交叉污染，同时还可以用来杀灭实验产生的废弃细胞以减少生物污染，是一种细胞灭活、减少细胞交叉污染的办法。