耐受性树突状细胞的研究进展

孙庐云,丁 喆,陈 鹏,刘 锋,宝福凯*,胡明道*

(昆明医科大学a．第二临床学院;b．病原生物学与免疫学系,中国云南昆明650500)

树突状细胞(dendritic cell,DC)是机体内最强的抗原呈递细胞,在激活适应性免疫和促进免疫耐受过程中均发挥着重要作用,其中能够诱导免疫耐受的DC群被定义为耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cell,tolDC)。tolDC可诱导移植后同种异体移植物的持久免疫耐受性,抑制移植排斥反应与自身免疫疾病的发展[1]。实施器官移植术后的病人需终身服用免疫抑制剂,但长期服用免疫抑制剂易产生耐药性和药毒性,还可能引起机体更严重的排斥反应[2]。机体的免疫耐受性决定了受体对供体器官的接受程度。因此,提高受体免疫耐受性可显著降低移植术后的排斥反应及相关并发症,增加供体器官存活率,提高患者的生活质量。目前,多项研究揭示了tolDC应用于移植和自身免疫性疾病治疗的机制,这对减少移植排斥后的感染和其他病变的发生具有重要意义。

1 tolDC诱导免疫耐受

T细胞应答是机体对抗原产生免疫反应的关键环节,DC可诱导T细胞的活化与耐受,具有双重功能。DC在体内识别抗原后通过3个阶段激活T细胞增殖。首先通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)和T细胞受体(T cell receptor,TCR)结合上调MHCⅡ,然后共刺激因子和共刺激因子受体结合,上调CD80和CD86的表达,最后刺激T细胞生长因子,促进T细胞增殖。与免疫刺激相反,进入外周组织定居分化的tolDC向T细胞呈递抗原后则表现出免疫抑制。

tolDC由未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)和半成熟树突状细胞(semimature dendritic cell,semiDC)组成,主要介导T细胞的失活、凋亡以及诱导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的生成。未成熟的DC低表达CD80、CD86、CD40和MHC,这些因子是激活T细胞所必需的辅助因子。因此,由于缺乏多种共刺激分子,imDC和semiDC不能活化T细胞,这导致抗原提呈后T细胞的无能或低能反应。此外,tolDC表达吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3 dioxygenase,IDO),IDO可催化色氨酸降解为各种色氨酸衍生的代谢物,进而干扰T细胞生长周期、抑制T细胞增殖和促进T细胞凋亡;tolDC还过度表达抑制性分子,如人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)、程序性死亡配体-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2),以及增加其致耐受性潜力的半乳凝素[3～5]。另外,tolDC亦可通过表达血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抑制T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)的活性,与Treg建立抑制性反馈回路,同时HO-1能诱导血红素的分解代谢,而分解产生的一氧化碳可通过线粒体依赖性机制调节DC免疫原性。当用特异性HO-1诱导剂诱导tolDC后,IL-12p70表达降低,IL-10表达升高,tolDC耐受性增加;若阻断HO-1,tolDC的免疫调节能力将会丧失[6]。研究证明,在小鼠心脏移植中应用特异性的HO-1诱导剂可抑制DC成熟和同种异体T细胞增殖,从而延长同种异体移植物存活时间和延缓移植物排斥反应[7]。

Treg是维持机体免疫耐受的重要因素。tolDC通过细胞-细胞接触依赖信号、分泌靶向蛋白和细胞因子等机制来诱导Treg生成[8]。在器官周围的淋巴管中,tolDC分泌的IL-10可调节CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg)的分化和增殖[9];PD-L1与PD-1(programmed cell death-1)在T细胞上相互作用后加强Foxp3蛋白的表达,诱导T细胞失活,促进Treg生成[10]。而Treg通过分泌IL-10、转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)下调DC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子的水平,当DC成熟度下降,不能有效刺激T细胞的增殖反应时,则通过负反馈机制激活更多Treg细胞的生成[11]。此外,Treg对DC具有较强的粘附性,导致FasCIN(actin bundling protein)不能与DC有效结合,FasCIN是免疫突触形成中的一种重要肌动蛋白[12],对维持DC未成熟状态和耐受性具有重要意义。由此可见,tolDC能诱导机体生成Treg,Treg亦能调节tolDC的耐受性,tolDC和Treg的相互作用对诱导免疫耐受起了重要作用。

2 tolDC的体外诱导培养

tolDC主要由人血单核细胞(如CD14+细胞)、啮齿类动物骨髓细胞、非人灵长类动物CD34+细胞产生。不同的免疫抑制剂应用于自身免疫性疾病和移植后,也可通过不同的生物学机制促进tolDC生成。

2.1 地塞米松诱导培养

研究表明地塞米松(dexamethasone,DEX)可以阻碍DC分化、成熟和诱导凋亡,当联合使用DEX、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4后可在小鼠骨髓细胞、人类单核细胞中诱导培养产生高效耐受的tolDC[13]。不仅如此,DEX诱导产生的tolDC在脱离DEX刺激后仍能保持数天,甚至一周的耐受性[14]。然而,用DEX单一诱导产生tolDC时分化生成的细胞较少,这可能与DEX浓度和暴露于外界的时长有关[13,15]。Lee等[13]研究发现,联合使用DEX和米诺环素(minocycline,MIN)能有效增加细胞分化的数量;与DEX单一诱导相比,向DEX处理的培养物中加入MIN可使DC的产生增加至约220%,且MIN和DEX联合诱导产生的tolDC表现出的免疫耐受性至少等于或优于单一诱导产生的耐受性。

2.2 维生素D3诱导培养

维生素D3(vitamin D3,VitD3)是一种多效性激素,可调节机体钙的平衡,促进固有免疫的同时抑制适应性免疫,其诱导生成的tolDC会分泌大量IL-10,这一方面可促进调节性B细胞(regula tory B cell,Breg)的生成,抑制炎症反应,降低共刺激因子和MHCⅡ的表达,另一方面还能抑制T细胞活性、迁移和促进Treg生成[16～17]。研究显示,与其他培养方式相比,VitD3和DEX联合诱导培养的tolDC更能在营养不良(或缺乏)的内环境中生存,且具有较强的抗氧化能力,同时对同种异体T细胞增殖的抑制作用也要强于单一诱导培养产生的tolDC[18]。

2.3 雷帕霉素诱导培养

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)常被用作抗癌药物和免疫抑制剂,其中复合物mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)和mTORC2主要作用于DC。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)通过抑制mTORC1减少DC自噬和内源性抗原呈递功能,降低MHCⅡ和共刺激因子的表达,从而抑制DC成熟,调节DC功能[19]。研究表明,RAPA通过抑制丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine,Ser/Thr)蛋白激酶途径来抑制T细胞活性并促进Foxp3+Treg细胞分泌,其诱导分化的tolDC应用于小鼠心脏移植模型时能延长移植物的存活时间,间接促进外周免疫耐受和减少移植后的排斥反应[20]。

2.4 细胞因子诱导培养

具有免疫抑制作用的细胞因子具有诱导tolDC生成的功能,如γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、肝细胞因子和IL-12[21]。本实验室前期通过在体外恒河猴骨髓CD34+细胞中加入重组GMCSF、IL-4和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)得到了高纯度且典型的 tolDC[22]。不同的细胞因子所诱导培养的DC在功能上有一定差异。IL-10和TGF-β诱导培养的tolDC已广泛应用于动物实验和人类自身免疫性疾病的试验中。研究表明,IL-10和TGF-β诱导培养的tolDC具有更强的免疫耐受表型和促肿瘤逃逸作用[23];IL-10诱导生成的tolDC可以高表达CCR7,具有较强的迁移能力,且能诱导CD4+和CD8+T细胞抗原特异性失活及Treg生成[24]。另外,Boks等[25]发现IL-10诱导培养的tolDC在免疫耐受性和抑制 T细胞活性方面优于 VitD3、DEX、RAPA和TGF-β诱导培养的tolDC。因此,在免疫耐受治疗中IL-10诱导培养的tolDC被认为是最佳选择。最新研究发现,CD141和CD163可稳定地高表达于IL-10体外诱导培养的tolDC表面,这对筛选tolDC具有重要意义[26]。TGF-β诱导的tolDC一方面提供上调PD-L1,促进T细胞失活;另一方面通过下调MHC和共刺激因子的表达,抑制DC抗原呈递能力,从而维持DC的未成熟状态[12]。不同诱导剂量的IFN-γ对DC成熟度有一定影响,通常低剂量IFN-γ可诱导生成tolDC。Li等[27]发现IFN-γ通过犬尿氨酸-AhR途径维持IDO在tolDC中的表达,而受此影响生成的Treg对肿瘤细胞识别具有较强的敏感性。

除了上述几种诱导方法外,其他一些免疫抑制剂也可促进tolDC生成,例如:麦考酚吗乙酯[28]在啮齿类动物实验模型中被证实具有延长移植物存活时间、抑制T细胞增殖和DC成熟的功能;维甲酸[29]通过干扰NF-κB通路,抑制DC成熟和IL-12p70分泌。总的来讲,不同免疫抑制剂具有不同的细胞毒性,诱导分化和生成的tolDC的特征也各不相同(表1),因此,针对不同情况,应选择合适的体外诱导培养方法。

表1 不同体外诱导方法培养的tolDC的特征Table 1 The characteristics of tolDC cultured with different methods in vitro

3 tolDC相关的miRNA调控机制

miRNA是一种微小的调控性非编码RNA,它通过抑制转录或加速目标mRNA的降解,最终导致靶蛋白的合成受到抑制[30]。DC是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。目前越来越多的研究表明,miRNA参与调控了DC的发育分化、成熟、抗原提呈、活化T细胞功能及细胞因子的释放[31]。当机体受到外界刺激时,体内miRNA的表达会受到影响,其通过介导对DC功能的调控,进而影响机体免疫应答的过程。

miR-let-7i是最早发现的miRNA之一,当抑制miR-let-7i表达时,DC表面共刺激因子CD80、CD86的表达下调,同时促炎因子的表达下降,活化T细胞的能力降低,导致DC耐受性增加;此外,miR-let-7i的低表达还可以促进Treg生成[32]。相关研究报道,miR-let-7i通过结合SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)和BLIMP(B lympho cyte-induced maturation protein-1)的 3′非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)影响 DC 的分化成熟,诱导T细胞低反应性[33]。另有研究表明,miR-203在tolDC中的表达显著上调,而miR-135a的表达则显著下调,前者的作用靶点是SOCS3,SOCS3表达下调会持续激活STAT3信号通路,引起白细胞浸润,促炎因子IL-6分泌增多,最终影响tolDC的耐受性[34～35];后者会引起GATA-3(GATA binding protein-3)表达升高,IFN-γ表达减少,从而干预机体Th1/Th2平衡的调节过程,影响tolDC生成[36]。影响DC分化过程中很重要的一条通路便是Notch/Wnt信号通路。研究报道,miR-125a和miR-99b能共同调控Wnt1和JAG1(Notch 的配体)的表达,促进 DC 的分化[37～38]。miR-23b亦可抑制Notch/Wnt信号通路,除此之外,它还能抑制NF-κB信号通路,进而促进DC耐受性增加和Treg生成[39];miR-214促进Treg生成则是通过β-catenin信号通路[40]。另一方面,当DC受到Toll样受体和非Toll样受体刺激后能分泌一些细胞因子,这些细胞因子可参与T细胞分化过程,如IL-10和IL-17;其中,IL-17的表达受到miR-133b的调控,且miR-133b特异性表达于TH17细胞[41]。以上miRNA调节DC耐受性的主要过程如图1所示。另外,miRNA调控tolDC的具体靶标及相关研究可见表2。综上可知,一种miRNA可以调控多种信号通路,其通过不止一种机制调控DC以影响其耐受性,且同一靶标可能受多种miRNA调控。

miRNA广泛分布于动物体内,通过转录后水平的调节,参与细胞的生命活动,间接在固有免疫和适应性免疫系统中发挥着至关重要的作用[31]。一种miRNA可以调控的mRNA不止一种,不同的靶基因通过不同的途径影响着DC的耐受性,通过增加DC的耐受性,间接增强了移植物的耐受性、延缓了免疫排斥反应和自身免疫性疾病的发展,体现了基因靶向治疗在移植和自身免疫性疾病中的潜在应用价值。本课题组在前期培养、鉴定恒河猴骨髓来源的imDC[22]基础上,建立了恒河猴肝移植模型,着重研究抑制DC细胞miR-let-7i和miR-155后,恒河猴肝移植免疫耐受发生的机制。然而,复杂的调控网络之间关系错综复杂,不同的调控之间是否有联系还值得进一步探索。近年来,研究者对于miRNA调控机制的研究取得了较大进展,这有助于为进一步寻找依赖于tolDC的免疫治疗提供新思路。

表2 miRNA通过特定靶点调控tolDCTable 2 tolDCs regulated by miRNAs through specific targets

4 tolDC的应用

4.1 tolDC在移植中的应用

图1 miRNA介导的DC耐受性调节不同颜色的miRNA代表不同的状态,其中红色表示miRNA上调,绿色表示miRNA下调。miRNA介导DC耐受性增加的机制亦用不同颜色标识,其中红色表示生成增多,绿色表示生成减少或受抑制。Fig.1 Regulation of DC tolerance through miRNAsDifferent colors represent different states of miRNAs．Red represents the upregulated miRNAs,and green represents the downregulated miRNAs．Mechanisms which mediate increased tolerance of DCs by miRNAs are marked in different colors,with red indicating increased production and green indicating decreased production or suppressed state．

当患者对免疫抑制剂敏感或耐药时,tolDC注射已成为一种新型辅助治疗方式,其可通过改变DC和T细胞的反应来减少排斥反应。在啮齿类动物模型中,移植前一周向受体体内输注供体tolDC可延长移植物存活时间[42]。Peng等[43]用半乳凝素-1诱导的供体源性tolDC联合凋亡淋巴细胞注射后提高了Treg的反应性,促进了T细胞凋亡,从而延长了肝移植物的存活时间。在恒河猴的肾移植模型中,研究人员分别采用静脉注射和脉冲式静脉注射的方式向受体猴输入由VitD3和IL-10刺激产生的供体源性tolDC,结果显示:采用静脉输注方式输入供体源性tolDC后,移植物中供体的反应性记忆T细胞选择性减弱,同时CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4)和PD-1的表达上调,肾移植物存活时间延长[44];采用脉冲式静脉输注方式输入供体源性tolDC后,受体中IL-17的表达降低,T细胞反应性下降,肾移植物存活时间延长[45]。Zahorchak等[46]通过人血分离模拟实验证实VitD3和IL-10诱导分化的tolDC在抗成熟性方面优于其他诱导剂产生的tolDC;在tolDC中PD-L1/CD86比例越高,细胞效能则越好。目前,匹兹堡大学医学中心已将供体源性的由VitD3和IL-10诱导分化的tolDC联合霉酚酸应用于肝移植的临床Ⅰ期试验[47]。就tolDC的来源而言,在促进移植物存活方面,供体源性tolDC由于缺乏MHC、共刺激因子和促炎性因子的表达,更能促进特异性免疫耐受;从治疗价值考虑,供体源性tolDC也要优于受体源性tolDC[48]。当然,在移植中,炎症反应和某些免疫抑制剂的应用也可能引起细胞坏死或应激细胞的吞噬,刺激DC分化为成熟的免疫原性细胞,干扰tolDC免疫表型的稳定,影响tolDC的耐受性;尽管如此,已有临床研究表明,免疫抑制剂联合应用比单一应用疗效好,且不会干扰tolDC的活性[49]。综上所述,对于移植的细胞治疗而言,tolDC的来源、诱导方法、输注方式等均可能与其治疗效果息息相关。

4.2 tolDC在自身免疫性疾病中的应用

tolDC治疗已广泛应用于自身免疫性疾病的临床试验中,对某些疾病治疗的可行性已得到证实,如类风湿性关节炎、克罗恩病、Ⅰ型糖尿病等[50]。在多发性硬化症和视神经脊髓炎的1b期临床试验中,Nafarrate等[51]将体外诱导培养出的tolDC使用致病性自身抗原负载,再重新输入人体内实施治疗,结果显示:患者体内IL-10增加,IFN-γ减少,且Th0细胞向Th2细胞分化。抗原负载的tolDC治疗是一种特异性的治疗方法,不仅可模拟抗原和DC结合,直接刺激效应细胞,还能诱导产生抗原特异性效应T细胞。在Ⅰ型糖尿病的临床Ⅰ期试验中,Giannoukakis等[52]用针对CD40、CD80和CD86的反义寡核苷酸诱导培养的免疫抑制性tolDC治疗后发现,皮内给药较静脉给药更易产生免疫耐受性,且患者无明显不良反应;同时,应用自体tolDC治疗的患者其体内B220+CD11c-B细胞有效增加,但tolDC的疗效暂未得到证实。在大多数类风湿性关节炎患者中人们检测出了抗瓜氨酸抗体,瓜氨酸是合成L-精氨酸的前体,L-精氨酸具有抗排斥和增强免疫耐受的功能,Benham等[53]采取瓜氨酸抗原负载的tolDC对患者实施治疗后发现,Treg/T细胞比值增加,DAS28下降,且未诱发类风湿性关节炎的发作。此外,在治疗系统性红斑狼疮方面,有研究者提出通过靶向患者体内的DC并改变细胞表型促使其转换为tolDC,或通过基因工程技术改造tolDC,诱导患者体内生成特异的Treg[54]。由于各种自身免疫性疾病的发病机制不同,且患者的遗传背景也不同,因此tolDC的免疫疗法需视具体情况选择。随着二代测序技术的普及,tolDC转录谱特征[26,55]的分析对研究tolDC细胞表型、生物标记物具有重要意义,可为tolDC的免疫疗法奠定基础。

5 结语与展望

tolDC在抑制器官移植排斥和防止自身免疫疾病中有着广泛的应用前景,受到越来越多学者的重视。tolDC是适应性免疫反应的基础,可由多种药物诱导产生,且不同药物诱导的tolDC具有其独特的功能,这在不同的移植物、自身免疫性疾病实验模型和临床应用中已得到相应证实。值得注意的是,器官存在其独特的免疫耐受性,如肝移植术后,受体可在不服用任何抗排斥药的情况下对移植物不产生排斥反应。这可能与tolDC通过不同的外周免疫耐受途径介导移植免疫耐受和延长移植物存活时间有关,而tolDC具体如何识别相应途径和调节细胞因子,部分机制仍未清楚。另外,为了防止使用tolDC时对机体造成其他不良的免疫反应,应用于人体治疗的tolDC在功能稳定性、抗成熟性、纯度和数量等方面都具有较高的要求。因此,仍需要通过更多动物模型、体内实验尤其是临床试验来探索tolDC发挥免疫耐受的机制,这对将来移植免疫耐受和自体免疫性疾病的防治具有重大意义。