近地层臭氧浓度升高对大豆叶片氮代谢及产量的影响

牟琳，王岩，孙铭禹，周映彤，庄永辉，赵天宏

沈阳农业大学农学院，辽宁 沈阳 110000

近地层臭氧（O3）是太阳辐射下，由氮氧化物、挥发性有机化合物和一氧化碳反应而形成的二次光化学空气污染物（Pleijel et al.，2019）。近年来，由于工业化和城市化的快速发展，导致氮氧化物的排放量增加进而导致对流层臭氧浓度显著增加（Luo et al.，2020；Feng et al.，2015）。对流层中，由于强烈的氧化作用，高浓度水平的臭氧对人类和动、植物造成损害（赵天宏等，2013；Young et al.，2020）。臭氧污染限制作物生产力，损伤植株叶片（Bailey et al.，2019）。目前，有研究表明臭氧污染会严重降低作物的产量，2008—2010年间，大豆（Glycine max）产量约损失 2%—10%，西方小麦（Triticum aestivum）产量损失约为0—27%，亚洲小麦约为4%—39%，相比西方小麦，亚洲小麦对臭氧的敏感性更高（Schauberger et al.，2019）。

氮（N）是影响作物生产力的重要养分之一，大豆籽粒产量与全氮的吸收呈正相关（Santachiara et al.，2019）。研究表明，大豆籽粒产量和蛋白质浓度在生理上与大豆积累的氮有关（Nicolas et al.，2019；Sinclair et al.，2006）。氮代谢是植物生理反应的最根本过程，是氮在植株体内流动的途径，为植株的不同部位提供营养元素。氮代谢过程中，植物将外界环境的无机氮通过一些酶（硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶等）转化成植物可以吸收利用的有机氮（许振柱等，2004）。氮代谢途径包括3个：一是氮的无机同化，二是氨的同化，三是氨的有机同化（王乾钦，2011）。近年来，有研究表明，臭氧胁迫导致水稻（Oryza sativa）和小麦在生长发育过程中代谢途径及其功能受到影响，其叶片碳代谢途径受到促进而氮代谢途径受到抑制，进而造成水稻和小麦中参与其叶片氮的无机同化过程的硝酸还原酶活性和硝态氮含量随着臭氧浓度的升高而显著下降，小麦叶片经氨的有机同化形成的游离氨基酸含量显著升高，同时，臭氧胁迫对水稻根系和小麦叶片经氮代谢而形成的可溶性蛋白具有一定的抑制作用，进而导致根系活力衰退（黄益宗等，2012；黄益宗等，2013；郑有飞等，2013；张巍巍等，2009）。此外，臭氧胁迫下如毛竹（Phyllostachys pubescens）等植物会形成适应性的反应，臭氧浓度成倍增加处理后的毛竹经氮代谢而形成的可溶性蛋白含量显著增加（庄明浩等，2012）。

大豆是一种重要的经济作物，被认为是人民生活中最重要的粮食作物和油料作物，大豆蛋白质含量较高，同时也是对臭氧较为敏感的作物之一（Ullah et al.，2019；Sulieman et al.，2019；马莉，2018）。关于臭氧胁迫对大豆叶片氮代谢及产量的研究较少，本研究选用“铁丰 29号”大豆为试验材料，采用盆栽试验，在开顶式气室（OTCs）中通过增加臭氧浓度对大豆进行臭氧熏蒸，探讨近地层臭氧浓度升高条件下，大豆叶片内氮代谢相关指标和大豆产量的响应机制，为大豆生产应对臭氧浓度增加提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以“铁丰29号”栽培大豆为试验材料，此品种大豆属于杂交品种，叶片肥厚且浓绿，幼茎紫色，其具有长达130—133 d的生育期，适宜种植于中等或中等以上肥力的土壤中。试验所用土壤类型主要为草甸棕壤，土壤（0—20 cm）理化性质为全 P 0.57 g·kg-1，全 K 22.17 g·kg-1，全 N 1.18 g·kg-1，有机质 12.03 g·kg-1。

1.2 试验设计

于中国科学院沈阳农田生态系统国家野外站进行室外种植试验，在沈阳农业大学生态学实验室进行室内指标测定试验。在开顶式气室（OTCs）内进行大豆抽样蒸熏试验，OTCs长1.15 m，高2.4 m，横截面为正八边形并具有玻璃室壁。此外，试验中还用到的设备有O3发生器（中国，BGY-Q8，北理国科）、O3传感器（新西兰，S-900，艾尔科）以及数据分析与自动控制充气系统。试验期间，实际控制气室内气体浓度稳定（武红艳，2019）。

本试验采用传统的盆栽试验，在 PVC桶（高30 cm、直径33 cm）内进行种植，根据大田种植密度及PVC桶的面积计算出每桶播种8粒大豆种子，出苗后保留5株，2019年5月初播种，熏蒸试验于大豆出苗20 d后开始进行，每天熏蒸9 h（08:00—17:00），大豆成熟时停止熏蒸。设置3个不同水平的O3熏蒸处理，分别为CK（对照，O3浓度为45 nL·L-1）、T1（O3浓度升高，即 O3浓度 (80±10)nL·L-1）、T2（O3浓度升高，即 O3浓度 (120±10)nL·L-1），每个气室内3次重复。试验期间保证水分和肥料的一致，为防止氮肥的缺少或过多，在种植前施用硫酸钾（75 kg·hm-2）、尿素（105 kg·hm-2）、磷酸二铵（285 kg·hm-2），此外控制病虫害及杂草的影响。大豆取样期为分枝期（2019年7月22）、开花期（2019年8月9号）和结荚期（2019年9月2号）。

1.3 材料采集

采集后的大豆植株样品，立即用清水冲洗干净，将植株表面多余的水分用吸纸吸收干净，将植株分离成根、茎、叶等3个部分，其中一部分根、茎、叶剪碎后置于烘箱内，105 ℃杀青30 min后，80 ℃烘干至恒质量，用于干质量的测定；另一部分根、茎、叶用于指标测定。结荚期，收取大豆籽粒进行产量测定。

1.4 测定指标及方法

叶片氮代谢相关指标的测定：硝酸还原酶（NR）活性测定采用活体法（张志良，2016），谷氨酰胺合成酶（GS）测定采用邹琦（2003）的方法，谷氨酸合酶（GOGAT）测定参考张韫璐（2018）的方法，硝态氮测定采用水杨酸法（邹琦，2003），亚硝态氮测定采用王乾钦（2011）的方法并加以改进，游离氨基酸采用水合茚三酮法（王乾钦，2011），可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝 G-250法（邹琦，2003），产量测定采用分析天平称重法。

1.5 数据处理分析

本试验数据运用Microsoft Excel 2016软件进行处理，运用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），检验臭氧浓度升高对大豆叶片氮代谢相关指标及产量的影响，对大豆叶片氮代谢相关指标进行Pearson相关性分析。实验数据采用平均值±标准差，3次重复。

2 结果与分析

2.1 臭氧浓度升高对大豆叶片氮代谢相关指标的影响

2.1.1 臭氧浓度升高对大豆叶片硝酸还原酶（NR）的影响

图1 臭氧浓度升高条件下大豆叶片硝酸还原酶活性Fig. 1 Nitrate reductase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由图1可知，大豆叶片硝酸还原酶活性在臭氧胁迫下存在下降趋势。分枝期，T1和 T2条件下，与 CK相比，大豆叶片硝酸还原酶活性分别下降63.48%和68.17%，且存在显著差异（P＜0.05），但T1和T2处理间差异不显著。开花期和结荚期，CK、T1和 T2两两之间差异显著（P＜0.05），其中开花期在T1和T2条件下，分别显著下降50.56%和71.79%，结荚期在T1和T2条件下，分别显著下降51.20%和75.39%。

2.1.2 臭氧浓度升高对大豆叶片谷氨酰胺合成酶（GS）的影响

图2 臭氧浓度升高条件下大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力Fig. 2 Glutamine synthetase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由图2可知，在臭氧胁迫下，与CK相比，T1和T2条件下，叶片谷氨酰胺合成酶活力呈现出下降趋势。分枝期，T1和T2条件下，与CK相比大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力分别下降28.62%和49.51%，且差异显著（P＜0.05）。开花期，与 CK 相比，T1和T2条件下，大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力分别显著下降30.53%和53.69%，且差异显著（P＜0.05），但T1和T2处理间差异不显著。结荚期，CK和T1相比，大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力差异不显著，T1条件下，略下降9.72%，CK和T2相比、T1和T2相比，大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力差异显著（P＜0.05），与CK和T1相比，T2条件下，大豆叶片谷氨酰胺合成酶活力分别显著下降 22.92%和14.62%。

2.1.3 臭氧浓度升高对大豆叶片谷氨酸合酶（GOGAT）的影响

由图3可知，分枝期、开花期和结荚期，臭氧浓度升高条件下大豆叶片谷氨酸合酶活力整体下降。分枝期，T1和 T2条件下时，大豆叶片谷氨酸合酶活力与 CK相比分别显著下降 49.44%和73.61%（P＜0.05）。开花期，T1和T2条件下时，大豆叶片谷氨酸合酶活力与 CK相比分别显著下降29.03%和61.83%（P＜0.05）。结荚期，T1和T2条件下，大豆叶片谷氨酸合酶活力与CK相比分别显著下降33.91%和54.60%（P＜0.05）。

图3 臭氧浓度升高条件下大豆叶片谷氨酸合酶活力Fig. 3 Glutamate synthetase activity of soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

2.1.4 臭氧浓度升高对大豆叶片硝态氮的影响

由图4可知，分枝期，T1和 T2条件下，大豆叶片硝态氮含量与 CK相比显著降低，分别达到19.25%和 76.81%，且 T1和 T2相比差异性显著（P＜0.05）。开花期，T1和T2条件下，大豆叶片硝态氮含量与 CK相比显著下降，分别下降 37.52%和60.62%，且T1和T2相比差异性显著（P＜0.05）。结荚期，T1和T2条件下，大豆叶片硝态氮含量与CK相比分别显著下降 29.30%和 82.08%，且 T1和 T2间差异性显著（P＜0.05）。

2.1.5 臭氧浓度升高对大豆叶片亚硝态氮的影响

图4 臭氧浓度升高条件下大豆叶片硝态氮含量Fig. 4 The content of nitrate nitrogen in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

图5 臭氧浓度升高条件下大豆叶片亚硝态氮含量Fig. 5 The content of nitrite nitrogen in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

由图 5可知，分枝期，与 CK相比，T1和 T2条件下，大豆叶片亚硝态氮含量分别显著降低82.83%和 91.68%（P＜0.05），但 T1和 T2间差异不显著。开花期，与CK相比，T1和T2条件下，大豆叶片亚硝态氮含量分别显著降低68.71%和75.13%（P＜0.05），但 T1和 T2间差异不显著。结荚期，T1和T2条件下，大豆叶片亚硝态氮含量与CK相比分别显著下降14.74%和54.39%，同时，T1和T2间差异性显著（P＜0.05）。

2.1.6 臭氧浓度升高对大豆叶片游离氨基酸的影响

由图 6可知，分枝期，T1和T2条件下，大豆叶片游离氨基酸含量与 CK相比分别显著降低44.11%和56.87%（P＜0.05）。开花期，T1和T2条件下，大豆叶片游离氨基酸含量与CK相比分别下降11.94%和47.27%，且T2条件下差异显著，T1和T2处理间差异显著（P＜0.05）。结荚期，T1和T2条件下，大豆叶片游离氨基酸含量与CK相比分别显著下降 30.08%和 45.11%，且 T1和 T2间差异显著（P＜0.05）。

图6 臭氧浓度升高条件下大豆叶片游离氨基酸含量Fig. 6 The content of free amino acids in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

图7 臭氧浓度升高条件下大豆叶片可溶性蛋白含量Fig. 7 The content of soluble protein in soybean leaves under the condition of increasing ozone concentration

2.1.7 臭氧浓度升高对大豆叶片可溶性蛋白的影响

由图7可知，分枝期，T1和 T2条件下，大豆叶片可溶性蛋白含量与 CK相比分别显著下降23.11%和69.54%（P＜0.05），同时，T1和T2处理间差异显著（P＜0.05）。开花期，与 CK 相比，T1和T2条件下分别下降11.31%和56.70%，且T2条件下差异显著，T1和T2处理间差异显著（P＜0.05）。结荚期，与 CK相比，T1和 T2条件下分别显著下降47.22%和 79.55%，且 CK、T1和 T2两两之间均差异显著（P＜0.05）。

2.2 臭氧浓度升高对大豆产量的影响

由表1可知，大豆在臭氧胁迫条件下，受到臭氧的影响，其单株荚数、单株粒数和百粒质量在T1和T2处理下差异不显著，分别与CK比较差异显著（P＜0.05），单株粒质量在CK、T1和T2两两之间差异均显著（P＜0.05）。与CK相比，T1和T2处理下，大豆单株荚数下降幅度分别达到24.15%和33.62%，单株粒数下降幅度分别达到27.85%、37.50%，单株粒质量下降幅度分别达到20.93%和39.73%，百粒质量下降幅度分别达到8.20%和7.93%。T1条件下，臭氧胁迫对大豆单株粒数影响最大，其次是单株荚数和单株粒质量，T2条件下，臭氧胁迫对单株粒质量的影响最大，其次是单株粒数和单株荚数，而相比之下，臭氧浓度升高对于百粒质量影响相对较小。

表1 臭氧浓度升高条件下大豆产量Table 1 Soybean yield under the condition of increased ozone concentration

2.3 臭氧浓度升高条件下大豆叶片氮代谢相关指标间及产量的相关性

由表2可知，臭氧浓度升高条件下，大豆叶片氮代谢相关指标间相关性各有不同，硝酸还原酶与亚硝态氮呈显著正相关（P＜0.05），且相关程度处于中度相关；与游离氨基酸呈正相关但不显著，相关程度处于中度相关；与谷氨酰胺合成酶呈正相关但不显著，相关程度处于中度相关且相关系数略低于硝酸还原酶与游离氨基酸的相关系数；与谷氨酸合酶正相关但不显著，相关程度处于低度相关；与硝态氮和可溶性蛋白不相关。硝态氮与可溶性蛋白呈极显著正相关（P＜0.01），相关程度处于高度相关；与谷氨酸合酶呈显著正相关（P＜0.05），相关程度处于中度相关；与亚硝态氮、游离氨基酸、谷氨酰胺合成酶不相关。亚硝态氮与游离氨基酸呈显著正相关（P＜0.05），相关程度达到中度相关；与谷氨酰胺合成酶极显著正相关（P＜0.01），相关程度达到中度相关；与谷氨酸合酶低度正相关但不显著；与可溶性蛋白不相关。游离氨基酸与可溶性蛋白达到中度负相关；与谷氨酰胺合成酶达到极显著的高度正相关（P＜0.01）；与谷氨酸合酶不相关。可溶性蛋白与谷氨酰胺合成酶达到低度负相关；与谷氨酸合酶不相关。谷氨酰胺合成酶与谷氨酸合酶呈高度正相关。参与大豆氮代谢的硝酸还原酶、硝态氮、亚硝态氮、游离氨基酸、可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶均与产量达到高度正相关，且谷氨酰胺合成酶与产量之间具有显著相关性。

3 讨论

叶片是植物生长过程中，受外界影响较大的部位，叶片的营养元素氮及生长情况与植物内在生理因素和外在环境因素（光照、温度、水分和外界干扰等）均有关系。氮代谢途径传递植物体内的氮，影响植物生长所需的重要营养元素，总结其过程如下：

表2 大豆叶片氮代谢相关指标间及产量的相关性Table 2 Correlation between indexes of nitrogen metabolism and yield in Soybean Leaves

硝酸还原酶是一种限速酶，参与植物氮代谢途径并调节硝酸盐同化，对农作物的产量和品质有着重要的影响，可被看作植物营养的重要指标之一（赵念席等，2014）。目前关于氮素对于植物硝酸还原酶活性影响的研究较多，但关于臭氧胁迫处理的研究较少。王菲等（2019）研究表明，高氮处理下的烟草（Nicotiana tabacum）幼苗硝酸还原酶活性先降低后升高。于铁峰等（2017）研究表明，紫花苜蓿（Medicago sativa）叶片的硝酸还原酶活性随着氮水平的增加呈先增大后减小的趋势。本研究表明，臭氧升高条件下，大豆叶片的硝酸还原酶活性在分枝期、开花期和结荚期均逐渐降低，且活性差异变化显著。目前已有张治安（2007）研究表明大豆叶片含氮量与光合作用关系密切，大豆硝酸还原酶活性与光合速率正相关，同时张铭等（2019）研究表明臭氧胁迫导致大豆光合速率降低，抑制光合作用能力，致使大豆产量降低。因此，臭氧胁迫导致本试验结果的原因可能是臭氧污染影响大豆叶片光合速率，导致光合作用受到抑制，大豆叶片的氮循环受阻，进而影响大豆叶片的硝酸还原酶活性。硝酸还原酶在大豆叶片内将硝态氮还原成亚硝态氮，本研究中，大豆叶片硝态氮和亚硝态氮含量在分枝期、开花期和结荚期，臭氧浓度升高处理下均显著下降，可能与黄益宗等（2013）研究认为由于臭氧污染对土壤氮循环过程中涉及到的微生物造成影响，降低了土壤中的硝态氮含量，进而影响水稻叶片的硝态氮含量的原因相似，但亚硝态氮在分枝期和开花期，T1和T2臭氧处理下差异不明显，到了结荚期才出现显著差异，这表明T2浓度下的臭氧在大豆生育后期对大豆亚硝态氮的影响积累达到最大程度。

谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶在大豆叶片氮代谢途径中占据重要地位，同时二者受光合作用和呼吸作用的影响。本研究中，在臭氧熏蒸下的大豆叶片的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性降低，且部分差异显著。可能是因为谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶存在于植物叶绿体中，与光照强度、光合作用和光呼吸有关（许振柱等，2004），而金东艳等（2009）研究表明，臭氧对于大豆叶片的光合作用抑制显著，因此臭氧熏蒸降低了大豆叶片的光合作用从而导致合成谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的物质减少。

游离氨基酸是大豆叶片氮素水平状况的一种体现，与植物体内的氮代谢关系密切（张鑫，2010）。可溶性蛋白是大豆生长的重要养分。本研究中，大豆叶片的游离氨基酸含量随着大豆的生长呈现出先增后减的趋势。在臭氧胁迫下，大豆叶片的游离氨基酸处于显著下降的状态，这与Sun et al.（2014）关于臭氧暴露下大豆游离氨基酸含量随着臭氧浓度的增加而降低的研究结果一致，但开花期且臭氧浓度处于T1条件下时，游离氨基酸下降不显著且含量高于分枝期和开花期，说明此时大豆叶片抵御臭氧胁迫的能力较强。此外，本研究中，在大豆生长到结荚期时，大豆叶片可溶性蛋白含量很高。在臭氧污染下，可溶性蛋白的含量下降，部分达到了极显著的情况，这与郑有飞等（2013）关于小麦叶片可溶性蛋白含量随着臭氧浓度的增加而降低的研究结果相似，可能是由于氮代谢途径中合成可溶性蛋白所需的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性在臭氧胁迫下受到抑制所导致。同时，根据本研究的相关性分析可见，臭氧浓度升高条件下大豆叶片氮代谢过程中各个指标间具有一定的关联性。大豆叶片氮代谢关键酶受到臭氧胁迫时，则会导致氮代谢过程受到阻碍，进而导致其他氨基酸、蛋白质等物质受到显著的抑制作用。

有研究表明，臭氧胁迫影响大豆的气孔进而对大豆产量的影响明显（Zhang et al.，2017）。同时，有大量研究结果表明，地面臭氧浓度升高会损害玉米、大豆等农作物并造成产量降低（Mcgrath et al.，2015；Shalini et al.，2011）。本研究 T1条件下，大豆籽粒单株荚数、单株粒数、单株粒质量和百粒质量就出现了显著的降低，这说明臭氧胁迫对大豆产量的影响明显，这与田荣荣等（2016）研究结果相似，可能是臭氧抑制了大豆氮代谢途径，降低大豆的抗氧化性，大豆氮素供应不足，最终导致植株受损，籽粒减产。

4 结论

大豆叶片氮代谢指标和指标间、指标和产量间具有一定的相关关系，且大部分达到中度及以上相关关系。臭氧浓度升高显著降低了大豆叶片的硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性、谷氨酸合酶活性、硝态氮含量、亚硝态氮含量、游离氨基酸含量以及可溶性蛋白含量。臭氧浓度升高导致大豆的单株荚数、单株粒数、单株粒质量和百粒质量显著降低。说明高浓度臭氧抑制了大豆叶片的氮代谢功能，降低了大豆叶片生长所需的蛋白质含量，进而导致大豆生长情况受到影响，大豆产量显著降低。