Hh信号通路相关蛋白表达对老年局部晚期非小细胞肺癌放化疗敏感性的预测价值

陈华林 杨东红 王永存 罗怡平 李姝君 吴爱兵 杨志雄

(广东医科大学附属医院肺部肿瘤科，广东 湛江 524023)

局部晚期非小细胞肺癌(LA-NSCLC)〔1〕是指伴有纵隔淋巴结或锁骨上转移、侵犯肺尖部或纵隔，而未发现远处转移的非小细胞肺癌(NSCLC)。绝大多数LA-NSCLC因肿瘤邻近大血管或胸膜及淋巴结转移等原因而失去手术机会，因此，同步放化疗成为功能状态佳、不可手术的LA-NSCLC患者标准治疗方案〔2〕。但是由于放化疗抵抗等原因，同步放化疗对LA-NSCLC患者疗效并不显著，2年生存率不足30%〔3〕。在临床实践中也发现，放化疗在不同个体的LA-NSCLC患者中存在差异，约有1/3患者效果并不明显，这不但无助于临床治疗，甚至还会引起严重不良反应〔4〕。若在治疗前可以预测患者对放化疗的敏感性，就可以制定既有最佳疗效又对正常组织损伤小的最佳治疗方案。Hedgehog(Hh)信号通路是在脊椎动物组织分化、胚胎发育和器官形成中发挥重要作用的信号通路，最初认为当胚胎发育后成熟，Hh信号通路会自动关闭〔5〕。最新研究表明〔6〕，在肺癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞中Hh信号通路异常活化，并且该信号通路参与了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。目前，针对Hh信号通路不同靶点的干预治疗在恶性肿瘤治疗中取得了良好的效果，但是其与LA-NSCLC放化疗敏感性之间的研究罕见报道。基于此，本研究首先检测LA-NSCLC患者组织中Hh信号通路中关键蛋白：人类刺猬因子(Shh)、丁蛋白受体(Ptch)、胶质瘤相关癌基因同源蛋白(Gli)1表达，并随访患者放化疗结局，旨在探讨Shh、Ptch、Gli1对LA-NSCLC放化疗敏感性的预测价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2016年7月至2017年7月广东医科大学附属医院肿瘤中心收治的60例LA-NSCLC患者作为研究对象，男34例，女26例，年龄60～75岁，平均(68.3±8.2)岁。纳入标准：①有明确的病理诊断，且不能手术的LA-NSCLC患者(Ⅲa～Ⅲb)；②患者拟行放疗同步化疗；③治疗前有可以测量的病灶；④预计生存期≥6个月；⑤治疗前美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分0～1分，第1秒用力呼气容积(FEV1)>70%；⑥首次接受化疗和放射治疗；⑦年龄≥60周岁；⑧临床资料和随访资料完整；⑨治疗方案取得患者及家属同意，并签署知情同意书。排除标准：①具有手术指征；②合并其他部位恶性肿瘤；③卡氏(KPS)评分<70 分；④既往接受过抗癌治疗。另从医院病理标本库收集15例肺良性病变病理组织样本作为对照，其中男10例，女5例，年龄63～78岁，平均(70.8±6.4)岁。

1.2样本采集与检测方法 LA-NSCLC患者中有42例为纤维支气管镜取病理，18例为CT穿刺取病理，肺良性病变均为纤维支气管镜取病理。样本组织取出后，常规石蜡包埋，行两步免疫组化染色法(试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，检测操作严格按照试剂盒说明书，兔源性Shh、Ptch、Gli1多克隆抗体均购自美国Abcam公司，稀释浓度均为1∶1 000。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，抗原修复，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。由两位病理医师采用盲法阅片，采用半定量法计算染色评分，最终得分为染色强度×阳性细胞百分比。染色强度：0分为无染色；1分为弱染色；2分为中等染色；3分为强染色。阳性细胞百分比：0分为无染色；1分为阳性细胞比例<25%，2分为阳性细胞比例25%～50%；3分为阳性细胞比例51%～75%，4分为阳性细胞比例>75%。参考童未来等〔7〕报道，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分阳性()，9～16分为强阳性()；其中(-)为阴性表达，(+)、()、()为阳性表达。

1.3治疗方法 LA-NSCLC患者拟行同步放化疗，患者均接受局部放射治疗，总剂量60 Gy，按照2.0 Gy/次常规分割，5次/w，共计照射30次。患者从放疗第1天开始接受全身化疗，其中鳞癌患者采用顺铂+多西他赛(顺铂25 mg/m2，第1～3天；多西他赛75 mg/m2，第1天)，非鳞癌患者采用顺铂+培美曲塞(顺铂25 mg/m2，第1～3天；培美曲塞500 mg/m2，第1天)，每28天为1个周期，化疗不少于3个周期。

1.4疗效评价

1.4.1近期疗效评价 化疗3个周期后，采用胸上腹部CT评价类型，按照实体瘤的疗效评价标准〔8〕(RECIST 1.1)，完全缓解(CR)：靶病灶消失，肿瘤标志物正常；部分缓解(PR)：基线病灶长径总和缩小≥30%；疾病稳定(SD)：基线病灶长径总和有所缩小，但未达PR；或有所增加，但未达PD；疾病进展(PD)：基线病灶长径总和增加≥20%或出现新的病灶。其中CR+PR为放化疗敏感组，SD+PD为放化疗抵抗组。

1.4.2远期疗效评价 对患者进行常规随访，生存时间从放化疗第1天开始计算，观察患者总体生存率。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0统计软件进行独立样本t检验、χ2检验、Logistic回归分析。部分图形利用GraphPad Prism 7.0软件绘制。采用Kaplan-Meier法绘制LA-NSCLC患者生存曲线，生存率的差异采用Log-rank法。Cox回归模型分析影响患者生存的预后因素。

2 结 果

2.1Shh、Ptch、Gli1蛋白表达 LA-NSCLC组织Shh表达阳性率为70.0%(42/60)，Ptch阳性率为71.7%(43/60)，Gli1阳性率为78.3%(47/60)，肺良性病变组织分别为20.0%(3/15)、6.7%(1/15)和33.3%(5/15)，LA-NSCLC组织Shh、Ptch、Gli1蛋白阳性率明显高于肺良性病变组织(χ2=12.500、20.908、11.429,均P<0.05)，见图1。

图1 LA-NSCLC组织和肺良性病变组织Shh、Ptch、Gli1蛋白表达(SP，×200)

2.2放化疗敏感组和放化疗抵抗组临床资料比较 60例患者中CR 4例，PR 29例，SD 22例，PD 5例。按照近期疗效分为放化疗敏感组33例(CR+PR)和放化疗抵抗组27例(SD+PD)。放化疗敏感组Shh、Ptch、Gli1蛋白阳性率明显低于放化疗抵抗组(P<0.05)，两组其余临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 放化疗敏感组和放化疗抵抗组临床资料比较(n)

2.3影响放化疗近期疗效的危险因素分析 以对放化疗是否敏感作为自变量，将各临床资料代入多因素Logistic回归模型，结果显示，Shh、Ptch、Gli1蛋白表达是影响LA-NSCLC患者放化疗近期疗效的独立危险因素(均P<0.05)，见表2。

表2 Logistic回归分析影响LA-NSCLC放化疗近期疗效的独立危险因素

2.4LA-NSCLC患者生存预后的Cox回归分析 本研究随访截止日期为2019年5月31日，至末次随访，共有37例患者死亡。将相关指标纳入Cox多因素回归模型，结果显示Shh、Ptch、Gli1表达阳性是LA-NSCLC患者不良预后的危险因素(均P<0.05)，见表3。

表3 LA-NSCLC患者生存预后因素的Cox回归分析

2.5Shh、Ptch、Gli1表达与LA-NSCLC患者总体生存的关系 Shh、Ptch、Gli1表达阳性的LA-NSCLC患者总体生存时间较表达阴性者明显缩短(均P<0.05)，见图2。

图2 Shh、Ptch、Gli1表达阳性和阴性LA-NSCLC患者生存曲线

3 讨 论

Hh信号转导通路通过一条复杂的信号转导级联反应来执行其生物学作用〔9,10〕，其中Shh信号蛋白在整个信号通路中发挥重要调节作用。当Shh信号蛋白表达下调时，Ptch抑制跨膜蛋白Smo表达，从而阻断Hh信号通路。反之，当Shh与Ptch结合后，处于静息状态的Hh通路会并激活，同时启动下游转录因子Gli1，参与调控细胞的增殖、分化和侵袭等过程。研究表明〔11〕，Hh信号通路活化与多种恶性肿瘤的发生和进展密切相关，通路效应蛋白在相应的肿瘤细胞和组织中存在异常表达。Ohta等〔12〕等发现Hh信号通路在弥漫性胃癌侵袭、转移过程中起重要作用，其中Shh为关键分子，参与调控与EMT发生有关的分子的表达。Subramani等〔13〕发现Hh信号通路是通过激活 MMP-9 来促进胰腺癌细胞的侵袭、迁移能力，尤其Hh信号通路中的Gli1起主要作用。

Hh信号通路在NSCLC的研究较少，但是有限的报道中均提及了Hh信号通路在NSCLC中异常激活，并且可能参与了NSCLC的进展和远处转移。Fan等〔14〕在肺癌中观察到Hh信号通路异常激活，Hh信号通路上调了肿瘤细胞的增殖活性。Giroux等〔15〕发现了Hh 通路产物与NSCLC诊断之间的关系，尤其是Shh和Gli1的表达与临床病理因素和预后之间是有关联的，因此Hh通路可作为NSCLC的诊断标志。本研究显示，LA-NSCLC组织Shh、Ptch、Gli1蛋白阳性率明显高于肺良性病变组织，说明Hh通路在LA-NSCLC中也呈活化状态，有望成为一个新的治疗靶点。Hh信号通路不但在肿瘤发生、发展和转移中发挥重要作用，目前的少量研究同样显示Hh信号通路与放化疗敏感性具有相关性。Sims-Mourtada等〔16〕报道称，在43例有放化疗治疗抗拒的食管癌患者中，36例(83.7%)Hh信号激活且Gli1阳性，7例(16.3%)Gli1阴性，说明食管癌的放化疗抗拒与Hh信号激活有关。本研究也发现，在LA-NSCLC患者中，放化疗敏感组Shh、Ptch、Gli1蛋白阳性率明显低于放化疗抵抗组，并且Shh、Ptch、Gli1蛋白表达是影响LA-NSCLC患者放化疗近期疗效的危险因素。这一结果说明Shh、Ptch、Gli1等Hh信号通路关键蛋白可以作为LA-NSCLC同步放化疗近期疗效的预测指标，临床医生可以据此为患者制定个体化放化疗方案。

Gu等〔17〕采用免疫组化学染色检测了80例NSCLC患者组织标本中Hh通路效应蛋白的表达情况，结果发现所有Hh通路效应蛋白均呈高表达，并且相关蛋白表达水平越高，患者生存期越短，提示Hh信号通路可能与患者生存预后有关。Hh信号通路可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号和稳定细胞内p53、Bcl-2表达，通过抗凋亡作用降低对放化疗的敏感性，从而降低肿瘤治疗效果〔18,19〕。Jian等〔20〕报道称，Hh信号通路抑制剂(Cyclopamine)预处理肺癌A549细胞可以增加细胞对射线的敏感性，间接提示Hh信号通路活化可能是肺癌放疗抵抗的主要原因。本研究发现，虽然患者均接受了同步放化疗，但是Shh、Ptch、Gli1表达阳性的LA-NSCLC患者总体生存时间明显缩短，说明Hh信号通路也是影响患者远期疗效的因素之一。因此，LA-NSCLC患者治疗前应评估Hh信号通路状态，尽量选择Shh、Ptch、Gli1表达均为阴性的患者接受放化疗，有可能使其长期生存获益。