罗 丹,姜 敏,李柯翱,田树革
(1.新疆师范大学 化学化工学院,新疆 乌鲁木齐 830017;2.新疆医科大学 中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;3.新疆奇沐医药研究院,新疆 乌鲁木齐 830013)
虫草花属于真菌门,子囊菌纲,肉座菌目,麦角菌科,虫草属,是由子座即草部分与菌核即虫的尸体部分两部分组成的复合体。其性味甘温,入肺肾经,有补肺肾、止喘嗽、益虚损、扶精气之功,适用于肺肾两虚,精气不足,咳嗽短气,自汗盗汗,腰膝酸软,是一种药食同源的菌类[1,2]。虫草花是运用现代科技人工培育出来的可供人们食用的菌类新品种,市面上又称为蛹虫草,北冬虫夏草,蝉花等。虫草花的培养基是包含了天然虫草花生长发育所含的各种养分,包括谷物类、豆类、蛋奶类等[3,4]。虫草花中主要化学成分有氨基酸类,黄酮类,多糖类和核苷酸虫草素等,具有抗肿瘤,抗炎镇痛,抑菌抗感染,免疫调节等药理活性[5-10]。
本文以4 个不同产地虫草花为对象,对其总黄酮、总氨基酸进行含量测定,探究不同产地虫草花之间的品质差异,实验数据可以为虫草花进一步开发利用提供相关的化学成分含量参考,并对虫草花提取物的抗氧化活性进行了研究,以期为食用菌的开发利用提供科学基础。
K0-5200DE 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH-S4 型恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);AL-04 型电子天平(德国梅特勒托利多仪器有限公司);UV-2700 型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。
芦丁标准品(批号:100080-200707,中国药品生物制品鉴定所);精氨酸标准品(批号:20100504,安徽宏通生物工程有限公司);DPPH(批号:217-591-8,东京化工产业);NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、茚三酮等试剂均为分析纯;实验室用水为蒸馏水。
虫草花分别选自4 个产地,分别为新疆,云南,内蒙古,辽宁,经新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定为麦角菌科,虫草属。
总黄酮的提取 分别称取4 个不同产地的虫草花粉末2.00g 置于圆底烧瓶中,料液比1∶10,60%乙醇回流提取1.5h,重复两次,过滤,合并滤液,密封保存备用[11]。
总氨基酸的提取 分别称取4 个产地虫草花粉末各2.00g 置于圆底烧瓶中,料液比1∶10,加入65%乙醇回流提取2h,重复两次,过滤,合并滤液,密封保存备用[12]。
芦丁标准品溶液 准确称取5.00mg 芦丁对照品在50mL 容量瓶并用甲醇稀释至刻度,摇匀,获得浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液,存于4℃冰箱保存。
精氨酸标准品溶液:准确称取10.00mg 芦丁对照品在10mL 容量瓶并用水稀释至刻度,摇匀,获得浓度为1mg·mL-1的对照品溶液,存于4℃冰箱保存。
1.5.1 芦丁标准曲线的测定 参照文献[11]并做适当修改,精密吸取芦丁对照品溶液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL,分别置于5 个10mL 具塞试管中,每管加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL,充分摇匀,放置6min,加入0.3mL 10%硝酸铝溶液,摇匀,放置6min,最后加入4mL 4%氢氧化钠溶液,并用蒸馏水补足至刻度,摇匀,室温放置15min,以不含芦丁标准品的溶液代替品标准品溶液做空白对照,紫外可见分光光度计于波长510nm 处测定吸光度。以芦丁对照品溶液的浓度为横坐标,相应浓度下测得的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.5.2 精氨酸标准曲线的建立 参照文献[12]并做适当修改, 精密吸取 0.02、0.03、0.04、0.05 和 0.06mL精氨酸对照品溶液于5 支10mL 的试管中,分别加入1mL 2% 茚三酮溶液,pH 值为6.8 Na2HPO4缓冲溶液1.0mL,加蒸馏水定容至5mL,混匀,90℃水浴15min 后取出冷却至室温,以不含精氨酸标准品的溶液代替标准溶液作空白对照,紫外可见分光光度计于波长570nm 处测定吸光度,以精氨酸对照品溶液的浓度为横坐标,相应浓度下测得的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
参考文献[11,12]方法,取同一份标准品平行6份,在对应最大吸收波长处测定吸光度,考察实验精密度;同一份标准品每隔15min 测定90min 内的吸光度值,考察实验稳定性;同一批次样品平行6 份分别测定其吸光度,考察实验重复性;平行称取样品6份,加入适量的标准品,按照对应方法根据标准曲线计算出回收率和RSD 值,考察实验的加标回收率。
依次量取适当的虫草花提取液,根据1.5.1 和1.5.2 的方法在对应最大吸收波长处测定吸光度,根据回归方程得出样品溶液中总黄酮的浓度,计算出4 个不同产地虫草花中总黄酮、总氨基酸的含量。
参考文献[13-15]并做改动,将蒸干的虫草花提取物依次稀释得到 0.4、0.32、0.28、0.4、0.2、0.016、0.08mg·mL-1浓度的溶液。样品组:将2mL 样品溶液及2mL 1.0×10-4DPPH 加入同一试管中,摇匀,室温下暗处静置30min 后在517nm 处测定吸光度(A1);空白组:同时测定2mL DPPH 溶液与2mL 蒸馏水混合后的吸光度(A2);空白对照:测定2mL 样品溶液与2mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度(A3)。以VC为阳性对照,每个样品平行测3 次。
清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%
参考文献[13-15]并做改动,将蒸干的虫草花提取物依次稀释得到 0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1mg·mL-1浓度的溶液。A1:将 4.5mL 50mmol·L-1Tris-HCl 缓冲溶液加入试管中,25℃水浴20min,分别向试管中加入1mL 浓度梯度的样品溶液和0.4mL 25mmol·L-1邻苯三酚溶液,摇匀,25℃水浴 6min,加入 0.1mL 8mol·L-1的 HCl 终止反应,在 320nm 处测定吸光度;A2:用同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液;A3:用同体积的蒸馏水代替样品溶液。以VC 为阳性对照,每个样品平行测3 次。
清除率%=[1-(A1-A2)/A3]×100%
2.2.1 精密度实验 精密量取对应的标准溶液,用1.6 方法测定标准曲线的吸光度值。实验结果显示,虫草花的总黄酮、总氨基酸含量测定中其RSD 分别为1.41%、1.15%,精密度良好。
2.2.2 稳定性实验 适当吸取虫草花样品溶液,用1.6 方法测定标准曲线的吸光度值,在90min 里每隔15min 测定一次吸光度。结果显示,总黄酮、总氨基酸的RSD 分别为0.39%、0.45%,表明其在90min 内稳定性良好。
2.2.3 重复性实验 称取同一批次虫草花样品6份,适当吸取虫草花样品溶液,用1.6 方法测定标准曲线的吸光度值,根据标准曲线计算虫草花的总黄酮、总氨基酸的RSD 分别为0.24%、0.30%,重复性良好。
2.2.4 加标回收率(表2)
表2 加样回收率实验结果(n=6)Tab.2 Experimental results of sample recovery rate(n=6)
由表2 可知,总黄酮、总氨基酸的加标回收率分别为:(100.41±0.56)%,(101.67±0.48)%,RSD 均小于2%,说明方法稳定可行,实验结果准确。
表3 不同产地虫草花总黄酮、总氨基酸含量(n=3)Tab.3 Total flavonoids, total amino acid content of Cordyceps flowers from different areas(n=3)
从表3 可以看出,虫草花总黄酮含量新疆地区最高为 5.36mg·mL-1,云南地区最低为 3.98mg·mL-1,辽宁和内蒙古虫草花总黄酮含量差别不大;虫草花总氨基酸含量云南地区最高为21.88mg·mL-1,辽宁地区最低为18.99mg·mL-1,新疆,内蒙古地区虫草花总氨基酸含量差别不大。
按照1.8 实验方法测定不同产地虫草花提取物对DPPH 的清除作用,建立清除率-浓度曲线,见图1。
图1 虫草花提取物对DPPH 的清除作用Fig.1 Effect of Cordyceps Flower on DPPH
在实验设计的浓度范围之内,4 个产地虫草花提取物对DPPH 自由基的清除率随着浓度的增加而升高,具有一定的量效关系。虫草花提取物对DPPH自由基有明显的清除作用,新疆产地的虫草花提取物对DPPH 的清除作用相较于其他3 个产地清除作用明显。
按照1.9 实验方法测定不同产地虫草花提取物对超氧阴离子的清除作用,建立清除率-浓度曲线,见图2。
在实验设计的浓度范围之内,虫草花提取物对超氧阴离子的清除率随着浓度的增加而升高,具有一定的量效关系。新疆地区虫草花提取物对超氧阴离子清除作用相较于其他3 个地区清除作用明显。
虫草花具有治疗肺肾两虚,咳嗽短气,精气不足,自汗盗汗等功效,其资源丰富,开发前景良好,值得深入研究。本文中对4 个不同产地的虫草花进行了总黄酮、总氨基酸含量测定并评价虫草花提取物的抗氧化活性,本实验中方法学考察得出实验的精密度、重复性、稳定性、加样回收率均在误差允许范围内,实验结果具有可靠性。虫草花是一种人工培育的虫草子实体,其培养基种类、培养技术、种质资源质量水平都会影响虫草花的品质。实验结果表明不同产地虫草花受气候因素和人工培育技术影响其总黄酮、总氨基酸含量存在一定差异。同时从实验中可以看出,虫草花对DPPH 自由基、超氧阴离子两种自由基具有一定的清除作用且清除率与浓度呈正相关。实验证明,虫草花提取物具有较强的抗氧化活性,虫草花作为一种药食同源的的菌类,在保健食品中应用广泛,本文将为虫草花在抗氧化功能食品方面开发利用提供基础数据。