基于网络药理学竹沥活性成分甲酸治疗糖尿病的分子生物学机制研究

汪 磊，王 怡，王佳慧，梁天坚，赵铁建，郑 洋

广西中医药大学赛恩斯新医药学院(广西 南宁 530222)

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种受遗传因素和环境因素共同作用影响的内分泌代谢疾病，主要特征为血糖水平增高并伴有蛋白质、脂肪、碳水化合物代谢紊乱。根据美国糖尿病协会(ADA)对DM典型症状的分类，将DM分为1型糖尿病、2型糖尿病、其它类型糖尿病、妊娠糖尿病。近年来，DM发病率逐年增加，已成为世界上继心、脑血管疾病和癌症后威胁人类健康的严重疾病[1]。全球DM患病率8.8%，中国患病率10.9%[2]。DM影响着机体各个器官系统的功能：高血糖可导致内皮细胞受损，阻碍新生血管形成，增加高血压、动脉粥样硬化、肾功能不全等疾病的发生率；DM还可导致视力丧失、周围神经损伤、免疫功能障碍、中风等疾病[3]。因此对DM的治疗具有十分重要的意义，目前临床使用的降糖药种类繁多，但大都价格高昂，不良反应多。有研究表明[4]中药治疗DM具有多靶点，多途径，治疗成本低，疗效确切且不良反应少等特点。

竹沥(Succusbambusae)为禾本科植物淡竹及同属数种植物的茎经火烤后流出的淡黄色液汁[5]。晋代葛洪《肘后备急方》中提到竹沥水用开水兑服可治疗消渴症[6]；明代张介宾《景岳全书》记载竹沥可治消渴等病症[7]，但目前尚无竹沥与DM之间的研究报道。

甲酸(formic acid，FMT)是竹沥当中最主要的活性成分，化学式CH2O2，化学结构见图1。随着网络药理学和生物信息学的发展，使得研究中药活性成分及其作用的靶点基因有了可用的研究策略[8-9]，本研究通过对FMT作用靶点和DM相关靶点蛋白进行交互处理，得到FMT治疗DM的重要靶点蛋白，并对这些靶点蛋白进行生物信息学分析，获得竹沥治疗DM的分子生物学机制，希冀为基础实验提供科学参考。

图1 FMT分子3D结构

1 材料与方法

1.1FMT化学成分作用靶点筛选使用TCMSP数据库(http:ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)收集FMT作用靶点蛋白信息，通过UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库将获得的靶点蛋白转换为靶点基因，并设置物种为“Homo sapiens”，剔除重复、非人源与不规范的靶点。结合文献报道查找FMT已报道的靶点进行筛选补充。

1.2FMT作用靶点蛋白互作(PPI)网络的构建将“1.1”项所得的FMT作用靶点信息上传STRING 10.5在线软件(http://string-db.org)[10]，限定研究物种为人类，获得PPI网络图。将从STRING数据库导出的tsv文件导入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化分析，并得到网络分析结果。进一步设置节点大小与颜色反映度(degree)值大小，边的粗细反映Combined score大小，最终获得PPI网络。

1.3FMT与DM交互靶点的筛选以diabetes mellitus为关键词检索NCBI数据库，选择物种为Homo sapiens，得到1 958个与DM相关的基因。与“1.2”项获得的靶点进行交互比对，获得FMT治疗DM的潜在作用靶点。

1.4通路和基因的富集分析将Gene ID导入DAVID v6.8数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)和gProfiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)中，对重要靶点基因进行Pathway分析，然后勾选生物过程(BP)、分子功能(CC)、细胞成分(MF)对基因进行功能富集分析，筛选出来的核心通路用气泡图展现出来。

1.5网络靶点特性分析运用Cytoscape 3.6.1软件中插件Network Analyzer计算网络的拓扑参数。网络中节点之间如存在调控作用关系则以边相连。本研究基于平均最短路径、介数中心性、中心接近度、聚类系数、度值等参数评估节点在全网络中的关键性。

2 结果

2.1FMT作用的靶点信息根据TCMSP数据库以及经过文献检索查找得到552个FMT作用靶点，通过剔除重复、非人源与不规范的靶点，最终得到FMT的作用靶点232个，其中包括前列腺素环氧化物酶1(PTGS1)、一氧化氮合酶1(NOS1)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)、前胶原赖氨酸双加合酶2(PLOD2)、腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(AMD1)等。FMT的靶点相互作用见图2。关系网络中节点详细信息见表1(仅列度值最高的前20个靶点)。

图2 FMT作用靶点互作网络

2.2DM相关靶点及交互处理结果在NCBI中检索DM相关靶点基因，共筛选出1 958个基因，用筛选出来的基因构建了DM靶点数据库，将FMT作用靶点与DM靶点进行比对，得出FMT与DM相关发病机制的58个作用靶点，包括PTGS1、NOS1、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、前列腺素环氧化物酶2(PTGS2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、谷氨酸脱羧酶2(GAD2)、环氧水解酶2(EPHX2)等。其中56个重叠靶点[其中碳酸酐酶1(CA1)与半乳糖基转移酶(ABO)不在网络中]是FMT与DM作用的关键分子基础，并在关系网络中体现了较好的连通特性，见表2，图3，图4。

表1 FMT作用靶点互作网络拓扑学分析(度值排名前20)

图3 FMT靶点与DM发病相关靶点韦恩图

图4 FTM与DM交互靶点的互作网络

表2 FMT与DM交互靶点的拓扑学分析

续表2：

2.3FMT对DM作用靶点的生物信息学分析经DAVID数据库和gProfiler数据库GO分析得出236个BP，包括小分子代谢过程、药物代谢过程、有机酸代谢过程等；39个CC，包括细胞外间隙、细胞外小体、细胞外囊泡；35个MF，包括氧化还原酶活性、辅酶结合、辅因子结合等，见表3，图5。经DAVID数据库分析，共分析出44条信号转导通路，结果得到与DM相关度最高的16条相关通路，其中包括代谢途径信号通路、氨基酸生物合成信号通路、碳代谢信号通路、抗生素合成信号通路、酪氨酸代谢信号通路、糖酵解/糖异生信号通路、药物代谢-细胞色素P450信号通路、精氨酸生物合成信号通路、精氨酸与脯氨酸代谢信号通路等，见图6。

注：红色：MF(35)；黄色：BP(236)，绿色：CC(39)。图5 交互靶点蛋白GO功能分析图

表3 FMT对DM作用靶点的GO分析

图6 FMT对DM作用靶点的KEGG分析气泡图(前16条)

3 讨论

DM发病率正在快速增长，给人们的身心健康带来极大的危害。DM如果不及时控制，会对全身各种组织器官产生影响，造成各种危及生命的并发症。虽然新的降糖药物不断研发并应用于临床，但经济成本高昂，临床迫切需要寻找多靶点且安全价廉的降糖药。近年来中医药在防治DM上取得了较大的进步[11]。根据DM的病机和临床特点,其属于中医“消渴”“脾瘅”“鬲消”等范围，古代医家多认为,过食肥甘为其病因,“阴虚燥热”为其病机特点[12]。《黄帝内经》认为“心移热于肺，传为鬲消，火盛灼金，不能生水，故令燥渴。”竹沥归心、肺经，可泄心火和肺火，竹沥治疗DM具有中医理论依据。

本次研究通过TCMSP和NCBI数据库筛出FMT和DM的相关靶点分别为232和1958个，交互处理后得出FMT作用于DM靶点58个，这些靶点与DM发病密切相关，也是FMT治疗DM的重要作用靶点。PTGS是人体内合成前列腺素类物质的关键酶，有两个异构体PTGS1和PTGS2，PTGS及其产物可以调节人体血药、炎症等多种生理和病理的过程[13]。研究表明[14]DM患者血清肿瘤坏死因子(TNF)含量明显高于正常人，说明TNF与DM发病关系密切。外源性TNF对胰岛素的敏感性进行有效调节，且微血管病变患者的TNF水平相比无微血管病变患者明显升高，说明在DM的发生发展中，TNF可以诱导血管内皮细胞表达黏附分子，对炎症细胞进行黏附，将内皮细胞促凝血因子的水平增加，同时将纤溶酶原激活抑制因子的表达增加，从而逐渐形成血管血栓，对内皮细胞的血管平滑肌细胞进行刺激，促进细胞增殖导致血管病变[15-16]。基质金属肽酶(MMP)可以调节细胞外基质的降解，研究表明[17-19]DM慢性溃疡中MMP及其活性酶显著升高，即使在未发生溃疡的DM皮肤中也检测到MMP呈高表达,MMP和DM并发症的发生关系十分密切。乙醇脱氢酶1C(ADH1C)和乙醇脱氢酶1B(ADH1B)可以调控乙醇的代谢过程[20-21]，研究报道[22]ADH1C与乳腺癌的发生关系密切。在糖尿病肾病发生时，Ras家族成员A(RHOA)含量明显升高，RHOA信号系统通过调节肌球蛋白磷酸酶活性，使细胞浆内磷酸化肌球蛋白轻链水平提高，肌动和肌球蛋白交联增加，进而促进肌动蛋白微丝骨架聚合，对足细胞骨架结构与功能产生重要的影响，从而导致一系列糖尿病肾病的症状[23-25]。

网络节点的重要性往往通过网络中心性进行衡量，度中心性反映网络节点直接相邻节点的数目，是衡量节点重要性最简单直观的体现；紧密度中心性代表着信号传递在节点之间的速度；介度中心性认为网络中经过某一节点的最短路径数越多，则该节点影响力越大[26]。

在本次研究中，对FMT作用靶点和FMT作用于DM靶点分别构建了PPI网络图，在前者PPI中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、过氧化氢酶(CAT)、磷酸三糖异构酶1(TPI1)、2，4-二烯酰辅酶A还原酶1(DECR1)、丝氨酸羟甲基转移酶2(SHMT2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、丝氨酸羟甲基转移酶1(SHMT1)、精氨酸琥珀酸合酶1(ASS1)、谷氨酸草酰转氨酶2(GOT2)是度值排名前几位的靶点基因，说明FMT发挥药理作用与这些基因关系密切。在后者的PPI网络中GAPDH、CAT、TNF、PTGS2、TPI1、酪氨酸激酶(SRC)、丙酮酸激酶(PKM)、精氨酸酶1(ARG1)、HMOX1是度值排名前几位的靶点基因，说明FMT对DM发挥治疗作用于这些基因关系密切。通过对交互靶点的生物学过程、分子功能、细胞组分GO分析表明，FMT治疗DM的机制可能与药物代谢过程、有机酸代谢过程等生物过程密切相关，其作用靶点主要位于细胞外间隙、细胞外小体、细胞外囊泡等，这些靶点的功能主要包括氧化还原酶活性、辅酶结合、辅因子结合等。KEGG通路GO分析结果表明FMT治疗DM的效应通路主要富集在代谢途径信号通路、氨基酸生物合成信号通路、碳代谢信号通路、抗生素合成信号通路、酪氨酸代谢信号通路、糖酵解/糖异生信号通路、药物代谢-细胞色素P450信号通路、精氨酸生物合成信号通路、精氨酸与脯氨酸代谢信号通路等。

综上所述，本研究通过网络药理学技术，分析了竹沥活性成分FMT治疗DM的分子生物学机制，得出了FMT治疗DM可能的潜在靶点，为进一步理解药物有效成分-靶点-疾病相互作用机制提供重要理论依据，也为中医药治疗DM提供了新的思路。但是本研究仅限于网络药理学层面对治疗DM进行了初步研究，由于网络信息技术尚不全面、数据库资料准确性及实时更新等方面有待进一步提高等原因，具有一定的局限性。此外竹沥可能通过药物中的其它小分子等多种原因对DM间接起到调控作用。因此对竹沥中其它成分对DM的调控作用的研究和网络药理学结果的实验验证，将成为下一步研究的重要内容。