生物炭对铜污染土壤的修复及水稻Cu累积的影响

李荭荭,赵明柳,董海霞,唐守寅,王 果①

(1.闽南师范大学历史地理学院，福建 漳州 363000；2.福建农林大学资源与环境学院，福建 福州 350002)

铜(Cu)作为植物必需微量元素，参与了植物多种代谢过程，但土壤中Cu含量过高会对植物生长产生毒害作用，并且通过食物链影响人体健康[1]。农业生产中使用的杀菌剂(波尔多液)、在农田中施用未经过处理的畜禽粪便、矿区的开采活动等均会导致土壤Cu含量超标[2]。全国土壤污染状况调查公报显示，我国耕地土壤Cu点位超标率达2.1%。土壤中Cu的有效性与土壤pH、质地和有机质含量等性质密切相关，随着土壤pH值的提高，Cu在土壤中的移动性显著降低；土壤腐殖质能够与Cu发生紧密结合，形成稳定化合物，且分子量越大，芳构化程度越高的腐殖酸组分对重金属的钝化能力越强[1],[3]253-263。

生物炭是生物质原料在特定炭化条件下，不完全燃烧所产生的富炭物，具有丰富的比表面积、表面官能团和矿质元素[4]。生物炭通过提高土壤pH，促进CO32-、PO43-与土壤重金属形成络合物，同时生物炭灰分中的一些元素会与重金属产生共沉淀，从而降低重金属在土壤中的生物有效性[5]。MEIER等[6]研究发现在砂壤土中施加w=1%的鸡粪生物炭和燕麦壳生物炭，可使土壤可交换态Cu含量分别降低62%和68%；JONES等[7]在硫酸铜污染土壤中施加生物炭，显著降低Cu的有效性；AHMAD等[8]研究表明大豆秸秆对土壤中Cu的钝化效果优于松针热解的生物炭，施加w=10%的大豆秸秆生物炭使土壤可提取态Cu含量下降86.73%。同时，生物炭能够显著降低作物对土壤中Cu的吸收累积[7,9]。但也有研究[10]表明猴头菇菌糠生物炭虽然降低了玉米根系Cu含量，而茎和叶Cu含量均升高。因此，生物炭对植物吸收累积Cu的影响存在不确定性。

重金属活性随土壤田间含水量不同而呈明显差异。水田环境土壤pH和氧化还原电位随淹水时间的增加会发生变化，从而改变土壤中重金属的吸附、解吸、沉淀等物理化学平衡[11]；此外，长期淹水后，土壤中会产生大量还原性物质，从而直接或间接影响土壤对重金属离子的吸附[12]。已有研究[13]表明在土壤中施加生物炭能增加土壤氧化还原电位范围，影响重金属离子活性。现有研究大多在旱作环境进行，有必要探讨淹水条件下生物炭对土壤Cu有效性的影响。水稻是我国广泛种植的主要粮食作物，其生长环境处于长期淹水状态，且不同品种水稻对重金属的吸收累积存在较大差异[14]。选择2个杂交稻品种和1个常规稻品种进行水稻盆栽试验，探讨淹水条件下生物炭对土壤中Cu的钝化效果以及水稻不同生育期对Cu吸收累积的影响，以期为生物炭修复Cu污染稻田土壤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自福建省三明市某矿区周边农田土壤。采集表层20 cm的土壤，经过自然风干、粉碎、过1 cm孔径筛后，混匀备用。供试土壤基本理化性质如下：Cu总含量为77.2 mg·kg-1，pH为6.05，有机质含量为21.86 g·kg-1，CEC含量为17 cmol·kg-1，粉粒(粒径为0.002～<0.02 mm)、砂粒(粒径为0.02～<2 mm)和黏粒(粒径<0.002 mm)占比分别为48.21%、44.56%和7.23%。

制备生物炭所用水稻秸秆取自福建省福州市闽侯县未受污染的农田。将晒干的水稻秸秆剪成1 cm的碎片，再用灰分炉热解，以10 ℃·min-1的速率升温，达到目标温度500 ℃后，保持热解温度2 h，待冷却后，取出生物炭。热解过程在通氮气条件下进行。生物炭基本性质如下：pH为10.2，BET比表面积为18.64 m2·g-1，w(C)为46.65%，w(N)为1.16%，w(S)为0.14%，Cu含量为21.05 mg·kg-1。

3个水稻品种分别为特优009(籼型3系杂交稻，T)、东联5号(籼型常规稻，D)和宜优673(籼型3系杂交稻，Y)，均为福建省常见水稻品种。

1.2 盆栽试验

试验于福建农林大学博学楼盆栽房内进行，种植期间日最高气温平均为32.47 ℃。每种水稻的盆栽土壤设3个生物炭添加水平，w分别为0(CK)、2.5%(B1)和5.0%(B2)，特优009水稻品种的3个处理分别标记为TCK、TB1和TB2，东联5号水稻品种的3个处理分别标记为DCK、DB1和DB2，宜优673水稻品种的3个处理分别标记为YCK、YB1和YB2。每个处理设3个重复，共27桶水稻盆栽。将7.5 kg土壤与生物炭和底肥(2.1 g尿素、1.2 g NH4H2PO4和2.1 g K2SO4)混合均匀后，装入直径20 cm、高25 cm的桶中，加水平衡1周后待用。

将3个品种的水稻种子分别用w=0.5%的NaClO溶液浸泡15 min，洗净后催芽，将发芽的水稻种子移栽到育秧盘上育秧。育秧25 d后移栽水稻，每桶种植5株水稻。分别在水稻分蘖期和孕穗期进行追肥，整个盆栽过程保持5 cm的水层。

1.3 样品采集

在水稻抽穗前测量水稻株高，株高为水稻基部至最长叶叶尖的长度。在水稻分蘖期和成熟期采集水稻样品和土壤样品，分蘖期每桶采收3株水稻、200 g土壤；成熟期每桶采收2株水稻和200 g土壤。将采集的水稻根系清洗干净，取少量根系放入-80 ℃冰箱保存。将水稻剩余根系和其他各部位样品以105 ℃杀青30 min后，在70 ℃条件下烘干至恒重，并称重，再用食品粉碎机粉碎；将水稻稻壳与糙米分开，并分别粉碎。收集的土壤经风干后，粉碎过2 mm孔径筛，再选取25 g土壤用玛瑙研钵粉碎过0.149 mm孔径筛，保存待用。

1.4 测定方法

土壤和生物炭的pH值采用pH计(SevenCompact，Mettler-Toledo，Greifensee，Switzerland)测定，条件分别为m(土)∶V(水)=1∶5和m(生物炭)∶V(水)=1∶10；土壤水溶态有机碳(WSOC)含量采用TOC分析仪(model 5000A，Shimadzu，Japan)测定，条件为m(土)∶V(水)=1∶25；土壤有效态铜含量采用0.1 mol·L-1CaCl2溶液按m(土)∶V(液)=1∶5浸提；土壤中弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态Cu占比采用BCR连续提取法[15]分析；植物样品利用微波消解仪进行消解；土壤和植物样品Cu含量采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，NexION 300X，Perkin Elmer，USA)测定。

选择宜优673水稻根系，采用冷冻切片机(CM1950，Leica Biosystems，Germany)切片后，利用激光烧蚀与电感耦合等离子体质谱仪联用技术(LA-ICP-MS)分析根系横截面中Cu的分布。

1.5 数据处理与统计分析

采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析；数据采用“平均值±标准误”表示(n=3)；采用Duncan′s多重比较方法进行差异显著性分析，显著性水平设为α=0.05；采用SigmaPlot 12.5软件绘图。LA-ICP-MS数据采用Excel 2013软件处理，并用OriginPro 8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 施加生物炭对土壤pH和水溶态有机碳的影响

不同生物炭施加处理对土壤pH的影响见图1。随着生物炭添加量的增加，3种水稻种植土壤pH在分蘖期和成熟期均显著增加。与对照相比，添加5%生物炭处理特优009、东联5号和宜优673水稻分蘖期土壤pH分别提高0.89、1.18和0.90；成熟期分别提高0.58、0.80和0.65。生物炭施加对东联5号水稻土壤pH影响最大，其次为宜优673，特优009最小。随着水稻种植时间增加，各处理土壤pH均呈下降趋势，但生物炭施加处理pH仍显著高于对照。这可能由于淹水时间增加，土壤中CO2溶解生成碳酸，导致pH降低。

由图1可知，在分蘖期和成熟期，随着生物炭添加量的增加，3种水稻土壤水溶性有机碳含量均显著提高。与对照相比，TB2、DB2和YB2处理分蘖期土壤w(WSOC)分别提高118.7%、86.74%和66.54%；成熟期分别提高17.44%、49.66%和34.35%。但成熟期各处理土壤水溶性有机碳含量均低于分蘖期。这可能由于在厌氧微生物作用下，土壤中有机物质转化形成CH4，并且排放到大气[16]，使土壤中可溶性有机碳含量降低。

TCK、TB1、TB2、DCK、DB1、DB2、YCK、YB1和YB2分别为特优009、东联5号和宜优673水稻添加w为0、2.5%和5.0%生物炭处理。

2.2 施加生物炭对土壤Cu有效性及其形态的影响

生物炭施加对土壤CaCl2提取的有效态Cu含量的影响见图2。随生物炭施加量的增加，土壤CaCl2提取的有效态Cu含量显著降低。与对照相比，TB2、DB2和YB2处理分蘖期土壤有效态Cu含量分别降低75.16%、73.78%和78.96%；成熟期分别降低87.61%、96.97%和95.61%。可见，成熟期添加生物炭对土壤有效态Cu含量降低的影响程度显著大于分蘖期(P<0.05)。

TCK、TB1、TB2、DCK、DB1、DB2、YCK、YB1和YB2分别为特优009、东联5号和宜优673水稻添加w为0、2.5%和5.0%生物炭处理。

生物炭施加对土壤中各形态Cu占比的影响见图3。由图3可知，土壤中Cu主要以残渣态存在，占比达60%，其次为可还原态和可氧化态，弱酸提取态Cu占比最低。

TCK、TB1、TB2、DCK、DB1、DB2、YCK、YB1和YB2分别为特优009、东联5号和宜优673水稻添加w为0、2.5%和5.0%生物炭处理。

随生物炭施加量增加，土壤中弱酸提取态Cu占比显著降低。在分蘖期，与对照相比，添加5%生物炭处理特优009、东联5号和宜优673水稻土壤弱酸提取态Cu占比分别降低0.63、0.71和0.58个百分点，降幅分别为40.90%、49.21%和42.11%；3种水稻土壤可还原态Cu占比增幅分别为9.10%、33.60%和27.34%；而土壤可氧化态和残渣态Cu占比变化较小。

由图3可知，在成熟期，与对照相比，添加5%生物炭处理特优009、东联5号和宜优673水稻土壤弱酸提取态Cu占比降幅分别为38.34%、47.88%和48.72%；宜优673水稻土壤可还原态Cu占比随生物炭施加量的增加而降低，降幅为16.87%；特优009和东联5号水稻土壤可还原态Cu占比变化不显著；3种水稻土壤可氧化态Cu占比随生物炭施加量的增加而升高，增幅分别为34.24%、46.04%和36.39%。

可见，生物炭使水稻分蘖期土壤中弱酸提取态Cu转化为可还原态Cu，而成熟期土壤弱酸提取态和可还原态Cu转化为可氧化态Cu。这表明随水稻种植时间增加，土壤中Cu逐渐由弱酸提取态转化为可还原态，再转化为可氧化态。

2.3 不同形态Cu与土壤性质之间的关系

随着生物炭施加量的增加，土壤pH、WSOC和不同形态Cu均发生变化。为探讨土壤性质对不同形态Cu的影响，分析了土壤性质与不同形态Cu之间的相关性(表1)。由表1可知，在分蘖期，土壤pH与土壤有效态Cu、弱酸提取态Cu之间均呈极显著负相关(P<0.01)，土壤WSOC与土壤有效态Cu、弱酸提取态Cu之间也呈极显著负相关(P<0.01)；在成熟期，土壤pH和WSOC分别与可还原态Cu呈显著负相关，但土壤pH和WSOC与可氧化态Cu均呈显著正相关。这表明生物炭通过提高土壤pH值和WSOC含量来影响土壤Cu的有效性及其形态。

2.4 生物炭对水稻生长的影响

生物炭对3种水稻株高及各部位生物量的影响见表2。由各品种对照处理可知，特优009和宜优673水稻株高较低，叶片干重较大；而东联5号水稻株高较高，叶片干重较小。添加2.5%生物炭对3种水稻株高均无显著影响；当添加比例增加到5%时，特优009和宜优673水稻株高分别显著增加4.7和5.3 cm，而东联5号水稻株高无显著变化。随生物炭施加量增加，东联5号叶片干重显著增加，而特优009和宜优673水稻叶片干重无显著变化。可见，与常规稻(东联5号)相比，生物炭对杂交稻(特优009和宜优673)株高的影响较大，对叶片干物质累积的影响则较小。此外，生物炭能显著提高特优009和东联5号水稻茎干重。总体而言，生物炭对水稻生长有一定促进作用。

表1 土壤性质和不同形态Cu的Pearson相关性分析

表2 生物炭对水稻株高和各部位生物量的影响

2.5 施加生物炭对3种水稻各部位Cu含量的影响

不同处理3种水稻植株内Cu含量变化见表3。3种水稻根系对Cu的累积存在差异，分蘖期和成熟期水稻根系Cu含量由高到低均为特优009>东联5号>宜优673。

表3 水稻各部位Cu含量

与分蘖期相比，成熟期各处理水稻根系Cu含量均有所降低，这可能由于水稻在成熟期进行生殖生长，将Cu运输到水稻籽粒中。随生物炭添加量的增加，水稻根系、谷壳和糙米Cu含量均呈显著下降趋势。与对照相比，在分蘖期，添加5%生物炭处理特优009、东联5号和宜优673水稻根系Cu含量分别下降51.54%、33.61%和47.94%；成熟期水稻根系Cu含量分别下降53.06%、36.54%和35.08%，谷壳Cu含量分别下降33.74%、33.66%和19.83%，糙米Cu含量分别下降33.99%、28.39%和40.22%。可见，在3种水稻中，生物炭对特优009水稻根系吸收Cu的抑制作用最强。

2.6 施加生物炭对Cu在水稻根系中分布的影响

以宜优673为例，探究生物炭对Cu在水稻根系横截面中分布的影响。对照和添加5%生物炭处理宜优673水稻根系横截面中Cu分布见图4。由图4可知，Cu主要分布在水稻根系的中柱和皮层；对照处理Cu在中柱和皮层的信号较强，且Cu在中柱的信号值高于皮层；添加5%生物炭后，根系中柱中Cu的信号强度明显减弱。可见，生物炭能抑制Cu在水稻根系皮层和中柱中的累积。

红色表示Cu信号强，蓝色表示Cu信号弱。A和A1为对照水稻根系切片，B和B1为5%生物炭处理水稻根系切片。

2.7 水稻各部位Cu含量与其在土壤中形态的关系

水稻根、谷壳和糙米Cu含量与土壤中不同形态Cu之间的相关性分析见表4。

表4 水稻各部位Cu含量与土壤不同形态Cu的Pearson相关性分析

由表4可知，成熟期糙米Cu含量与水稻根系Cu含量之间呈极显著正相关。水稻根系、谷壳和糙米Cu含量与土壤有效态Cu和弱酸提取态Cu之间呈极显著正相关，其相关系数分别为0.527、0.573和0.699以及0.720、0.689和0.794，这表明水稻Cu含量与土壤弱酸提取态Cu之间的相关性更强。水稻根系、谷壳和糙米Cu含量与土壤可氧化态Cu之间呈显著或极显著负相关。水稻Cu含量与土壤可还原态和残渣态Cu之间相关不显著。

3 讨论

3.1 生物炭降低土壤Cu有效性的机制探讨

随生物炭施加量的增加，土壤中CaCl2提取的有效态Cu和弱酸提取态Cu含量均显著降低，且转化为更稳定的可氧化态Cu(图2～3)，其可能机制如下：(1)生物炭与土壤中铜离子直接作用，降低其有效性。生物炭为多孔隙结构，比表面积较大，同时含有丰富的π电子，能直接从溶液中吸附重金属离子[17]。笔者研究中供试生物炭的BET比表面积为18.64 m2·g-1，生物炭通过表面吸附作用降低Cu在溶液中的移动性。也有研究[18]表明生物炭富含盐基离子，能够与土壤溶液中重金属离子进行交换，从而达到重金属固定作用。(2)生物炭具有一些带负电荷的酚羟基、羧基、羟基等碱性官能团[19]，随着生物炭施加量的增加，土壤pH显著升高。在分蘖期和成熟期，土壤pH与土壤有效态Cu、弱酸提取态Cu之间均呈极显著负相关(P<0.01，表1)。土壤pH是影响土壤重金属Cu有效性的重要因子，土壤中H+会与土壤颗粒表面基团产生竞争，减弱土壤对金属离子的固定[20]90-91；且在酸性条件下易形成重金属的氢氧化物，活化土壤中重金属离子；因此提高酸性土壤pH能减弱金属离子有效性[21]。(3)生物炭具有较高的碳含量，笔者研究中供试生物炭w(C)为46.65%。添加生物炭处理土壤可溶性有机碳(WSOC)含量显著提高(图1)；分蘖期和成熟期土壤有效态Cu、弱酸提取态Cu与WSOC含量均呈极显著负相关(P<0.01，表1)。土壤有机质表面含氧基团与重金属离子络合从而减弱金属离子的移动性[20]90-91，增加有机结合态重金属。笔者研究发现生物炭也显著提高成熟期土壤可氧化态Cu占比，且有机质能够削弱Cu对部分土壤微生物的毒害效应，增加微生物群落对Cu的固定，降低土壤Cu的有效性[22]。除此之外，成熟期土壤pH降低，使对照土壤弱酸提取态Cu高于分蘖期。但生物炭促使分蘖期土壤弱酸提取态Cu转化为可还原态Cu，成熟期土壤中弱酸提取态和可还原态Cu转化为可氧化态Cu。这可能是由于随着淹水时间增加，土壤中Cu2+被还原为Cu+，并与有机硫(Sorg)结合成较稳定的复合物Cu+-Sorg[23]；供试生物炭w(S)为0.14%，促进了淹水土壤中Cu+-Sorg的形成。

3.2 生物炭抑制水稻吸收土壤中Cu的机制探讨

生物炭对3种水稻生长均有一定促进作用。生物炭可提高特优009和宜优673(杂交稻)株高以及东联5号(常规稻)叶片干物质累积量。前人研究[24-25]表明，生物炭不仅含有丰富的养分元素，对土壤中硝态氮、铵态氮、磷和钾等不同形态养分元素都具有很强吸附能力，能减少养分流失，促进植物生长。笔者研究发现成熟期水稻根系Cu含量小于分蘖期，这可能由于水稻在进行生殖生长时，将Cu转运到生殖器官中。随生物炭施加量的增加，水稻对Cu的吸收累积量显著降低(P<0.05)。前人研究[26]表明植物对重金属离子的吸收与土壤中重金属的有效性密切相关。笔者研究发现水稻根系、谷壳和糙米Cu含量与土壤有效态Cu和弱酸提取态Cu之间呈极显著正相关(P<0.01)。另外，根系是植物阻挡土壤中重金属进入植物体内的第1道屏障，进入根系中的金属离子与细胞壁和细胞膜上的Ca2+和Mg2+交换或者与果胶结合而被固定，进入细胞内的重金属离子与金属硫蛋白结合再被转运到液泡中，最终削弱了重金属离子对植物的毒害作用[3]253-263，[27]。因此，大量Cu会累积在水稻根系中(表3)。未被土壤和根系固定的重金属离子需要经过植物根细胞质膜和根皮层细胞的横向运输以及木质部和维管束运输才能转移到地上部[28]；因此重金属离子在根系中的分布影响其向地上部的运输。笔者研究发现对照处理Cu主要分布在水稻根系中柱和皮层，且中柱中Cu的信号强度高于皮层，这与旱作植物云杉和白杨[29]不同。笔者研究还发现施加生物炭能抑制Cu从水稻根表向皮层和中柱的迁移，从而减少Cu向地上部的运输量。3种水稻中，虽然生物炭处理对特优009水稻根系吸收Cu的抑制作用最强，但宜优673糙米中Cu含量的降低幅度(40.22%)最大，这可能是受Cu在水稻体内迁移的影响。ZHENG等[30]研究表明，水稻会将Cu先分配到成熟的老叶，再通过老叶往稻米中转运，OsYSL16基因在该过程中起到重要作用。

4 结论

施加生物炭能显著增加土壤pH和可溶性碳含量，降低土壤CaCl2提取的有效态Cu含量，使移动性较强的弱酸提取态和可还原态Cu转变形成较稳定的可氧化态Cu，从而降低Cu在土壤中的有效性。随生物炭施加量增加，分蘖期和成熟期水稻根系中Cu累积量均显著降低，且成熟期水稻根系中Cu累积量少于分蘖期。Cu在水稻根系横截面中柱的分布高于皮层，且生物炭抑制Cu从土壤向水稻根系皮层和中柱的迁移，从而减少Cu进入水稻地上部。生物炭显著降低特优009、东联5号和宜优673水稻糙米中Cu含量。但笔者研究未能明确生物炭对Cu在水稻各器官之间迁移的影响，这将做进一步研究。