灯盏乙素对缺血性心力衰竭大鼠心肌重构的影响及其机制

张亚平， 刘智， 段玉龙， 赵军， 范蒙蒙， 刘玲

（1.平顶山市第二人民医院慢性病门诊，河南省平顶山市 467000；2.新乡医学院第一附属医院心内科，河南省卫辉市 453100）

缺血性心力衰竭（ischemic heart failure，IHF）是临床常见的危重疾病，属于中医学“胸痹”“心悸”“怔忡”“喘证”“水肿”等病证的范畴，病机复杂，证候多样。IHF的基本病机为气虚血瘀、虚实夹杂。随着我国人口老龄化的趋势，心力衰竭的发病率逐年升高，因此，探寻新的抗心力衰竭药物是临床研究的重要问题[1]。灯盏花是菊科植物短 亭飞 蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz 的干燥全草，味甘，性温，有散寒解表、活血舒筋、止痛、消积等功效。灯盏乙素（Breviscapine）是从灯盏花中提取的黄酮类化合物，具有抗凝血、抗血栓形成，改善血液流变性及微循环，并增加脑血流量，保护心肌缺血/再灌注损伤，提高机体耐缺氧能力等作用[2]。已有报道灯盏乙素与西药可联合用于冠心病、心肌梗死、高血压、房颤、高脂血症、病毒性心肌炎、肺心病等心血管疾病的治疗[3]。心肌重构是IHF 发展中的重要环节[4]。因此，本研究观察了灯盏乙素对IHF 大鼠心肌重构的影响及其机制，以期为IHF的预防和治疗及灯盏乙素的开发利用提供参考数据。现将研究结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物90 只成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，体质量180 ～200 g，购自河南省实验动物中心，动物质量合格证号：SYXK（豫）2016-0002。所有大鼠于平顶山市第二人民医院心内四科动物饲养室饲养，温度25 ℃左右、湿度50%左右，给予大鼠普通饲料适应性喂养1周。

1.2 药物与试剂灯盏乙素（纯度≥98%，上海邦景实业有限公司）；卡托普利（纯度≥99%，上海恒远生物科技有限公司）。RIPA 裂解缓冲液（南京海克尔生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海易色医疗科技有限公司）；Bax蛋白抗体（上海酶联生物科技有限公司）；Bcl-2 蛋白抗体、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）抗体（碧云天生物技术研究所）；胶原蛋白（Collagin）Ⅰ抗体、Collagin Ⅲ抗体、基质金属蛋白酶（MMP）-1 抗体、MMP-2 抗体、MMP-9 抗体（上海艾博抗生物科技有限公司）；山羊抗兔二抗（上海康培科技有限公司）；白细胞介素（IL）-18酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海抚生实业有限公司）；IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（上海联硕生物刻科技有限公司）；细胞间粘附分子1（ICAM-1）ELISA试剂盒（上海和序生物科技有限公司）。

1.3 仪器流式细胞仪（美国碧迪医疗器械有限公司）；DB128型无创尾动脉血压测量分析系统（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；MyLabTMSix 型彩色多普勒超声诊断仪（意大利百胜集团）。

1.4 分组、模型构建与给药将90只大鼠随机分为假手术组，模型组，灯盏乙素低、中、高剂量组，阳性对照组，每组15 只。除假手术组外，其他组别大鼠采用约翰斯法建立IHF 模型[5]。方法：首先将大鼠麻醉并在无菌手术条件下打开胸腔，心包分离，然后轻挤心脏，并用棉签轻抚左心耳，在左心耳与肺动脉圆锥之间结扎左前降支冠状动脉。观察大鼠的心电图变化，当出现S-T段水平向上或向下偏移0.1 mV 以上且结扎线以下心肌颜色变暗时，可判断为造模成功。假手术组不结扎左前降支冠状动脉，其他操作同上。从造模第3 天开始至8 周末，灯盏乙素低、中、高剂量组大鼠腹腔注射灯盏乙素（0.3、3、30 mg·kg-1·d-1）[6]，阳性对照组每天灌胃卡托普利（180 mg·kg-1·d-1）[7]，假手术组和模型组注射等量生理盐水。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 血压测量 应用DB128型无创尾动脉血压测量分析系统记录尾部收缩压、舒张压和心率。每个参数测量3次。

1.5.2 超声心动相关指标检测 所有大鼠在术后8周接受超声心动检测。用异氟醚麻醉大鼠，仰卧位固定，剃光胸部毛发，测量心室舒张末期室间隔厚度（iIVSd）、左心室收缩末期直径（LVIDs）、左心室舒张末期直径（LVIDd）、舒张早期二尖瓣血流速度/舒张晚期二尖瓣血流速度（E/A）比值。应用Teichholtz 方程导出射血分数（EF）和收缩分数（FS），并评估左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）。

1.5.3 左心室质量/体质量 称左心室质量、体质量、计算左心室质量/体质量。

1.5.4 苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠心肌病理损伤 每组随机剖取6只大鼠心脏，用40 g/L多聚甲醛固定，常规脱水制成石蜡切片。然后脱蜡、苏木素液染色。1% 盐酸酒精分化，0.6%氨水返蓝，0.5%伊红液染色。接着常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在400倍显微镜下观察心肌病理损伤情况。

1.5.5 流式细胞术检测大鼠心肌细胞凋亡 加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，离心弃上清，收集细胞，按1×106个/mL的细胞浓度重悬。细胞悬液中加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，在暗室里孵化15 min，然后，用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。

1.5.6 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌细胞凋亡标志蛋白cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及心肌重构相关蛋白CollaginⅠ、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2、MMP-9 蛋白的表达 使用RIPA 裂解缓冲液从心肌组织中提取总蛋白质，并用BCA 试剂盒检测浓度。将10 μg 蛋白质经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并转移至聚偏氟乙烯膜，用50 g/L脱脂乳封闭膜1 h。加入对应一抗（cleaved Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、 CollaginⅠ1∶500、 Collagin Ⅲ1∶500、 MMP-1 1∶1 000、MMP-2 1∶1 000和MMP-9 1∶500稀释），在4 ℃过夜。将膜与辣根过氧化物酶缀合的二抗一起温育。通过使用电化学发光系统显示蛋白质条带，使用Image J 软件进行蛋白质条带灰度的定量分析。

1.5.7 ELISA法检测心肌中炎症因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量选取大鼠心脏同一部位的组织，按质量体积比为1∶9 加入生理盐水，以3 000 r·min-1离心10 min后，取上清液加入各反应孔，37 ℃反应45 min。接着用洗涤液洗涤4 次，再加入生物素标记的抗体（IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α），在 37 ℃孵育 30 min。洗涤后加HRP 标记的链霉亲和素混合均匀，在37 ℃反应30 min，接着加入显色剂避光显色，最后加终止液终止反应，应用酶标仪进行检测。

1.6 统计方法采用SPSS 21.0统计软件分析实验数据，计量资料数据均以均数 ± 标准差（±s）表示。多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步组间两两比较采用LSD-t方法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较模型组大鼠除了呼吸困难甚至喘息、体质量减轻、毛发光泽减少外，还存在活动减少、精神萎靡；而灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠的这些情况均得到明显改善。在实验结束时，模型组和灯盏乙素低剂量组中各有1只大鼠死于慢性心力衰竭。模型组大鼠手术8 周后的体质量为（369.85± 47.26）g 明显低于假手术组（478.40±28.30）g（P＜ 0.05）；与模型组比较，灯盏乙素低、中、高剂量组大鼠体质量（389.12 ± 33.57）g、（423.55 ± 38.81）g、（457.24 ±42.34）g和阳性对照组大鼠体质量（468.34±29.87）g均明显增加，其中，灯盏乙素高剂量组和阳性对照组大鼠体质量与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明灯盏乙素可改善IHF 大鼠的一般情况。

2.2 各组大鼠收缩压、舒张压和心率比较图1结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的收缩压、舒张压和心率明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠的收缩压、舒张压和心率均有不同程度的升高，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。表明灯盏乙素可改善IHF大鼠的血压和心率。

图1 各组大鼠收缩压、舒张压和心率比较（±s，n=9）Figure 1 Comparison of the systolic blood pressure，diastolic blood pressure，heart rate in rats of various groups（±s，n=9）

2.3 各组大鼠超声心动相关指标比较表1 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠EF、FS、E/A明显降低（P＜ 0.05），LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 明显升高（P＜ 0.05），IVSd 无明显变化（P＞0.05）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠EF、FS、E/A 均有不同程度的升高，LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 均有不同程度的降低，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。表明灯盏乙素可改善IHF大鼠的心脏功能。

表1 各组缺血性心力衰竭大鼠超声心动相关指标比较Table 1 Comparison of the echocardiography related indexes in rats of various groups （±s）

表1 各组缺血性心力衰竭大鼠超声心动相关指标比较Table 1 Comparison of the echocardiography related indexes in rats of various groups （±s）

①P ＜0.05，与假手术组比较；②P ＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组灯盏乙素低剂量组灯盏乙素中剂量组灯盏乙素高剂量组阳性对照组n/只9 9 9 9 9 9 EF（p/%）68.2±9.3 48.7±7.2①50.2±7.6 55.5±8.4 61.4±7.8②62.2±8.5②FS（p/%）39.5±7.1 26.3±10.5①28.7±7.6 31.5±8.9 36.4±9.4②36.8±10.2②E/A 2.02±0.15 0.98±0.14①1.21±0.23 1.64±0.31 1.87±0.24②1.96±0.21②LVEDV 222.1±18.9 337.2±19.4①312.5±17.6 286.4±18.3 247.5±17.5②231.7±18.8②LVESV 72.5±9.8 118.4±17.5①102.3±15.6 95.6±14.7 78.2±12.3②74.3±11.2②IVSd 1.35±0.13 1.51±0.21 1.49±0.19 1.43±0.18 1.38±0.15 1.36±0.13 LVIDd 6.59±0.32 8.01±0.29①7.72±0.25 7.44±0.23 7.03±0.28②6.94±0.30②LVIDs 4.05±0.56 5.94±0.38①5.62±0.42 5.03±0.49 4.62±0.34②4.41±0.36②

2.4 各组大鼠心肌病理变化、左心室质量/体质量比较图2-A结果显示：假手术组大鼠心肌细胞形态正常，胞核清晰可见，排列整齐；模型组心肌细胞核严重浓缩，排列疏松、紊乱，有多处断裂，间质增宽并伴随有水肿现象；而灯盏乙素可呈剂量依赖性改善该损伤。图2-B 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的左心室质量/体质量明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性药对照组大鼠的左心室质量/体质量均有不同程度的减小，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。表明灯盏乙素可修复IHF大鼠的心肌损伤。

图2 各组大鼠心肌病理变化、左心室质量/体质量比较Figure 2 Comparison of the myocardial pathological features and ventriculus mass/body mass ratio in rats of various groups

2.5 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较图3-A，-B结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠心肌细胞凋亡率均有不同程度的减小，且灯盏乙素中、高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。图3-B，-C 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的心肌细胞凋亡标志蛋白cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2表达水平明显上调（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠的心肌细胞cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2 表达水平均有不同程度的下调，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。表明灯盏乙素可降低IHF大鼠的心肌细胞凋亡。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较Figure 3 Comparison of the cardiomyocyte apoptosis in rats of various groups

2.6 各组大鼠心肌重构相关蛋白Collagin I、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达比较图4结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠的心肌细胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-2 和MMP-9 表达水平明显上调（P＜ 0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠的心肌细胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-1、MMP-2和MMP-9表达水平均有不同程度的下调，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结果表明灯盏乙素可调节IHF大鼠心肌重构相关蛋白的表达。

图4 各组大鼠心肌重构相关蛋白CollaginⅠ、Collagin Ⅲ、MMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表达比较Figure 4 Comparison of the expression levels of rat myocardial remodeling-related protein Collagin I，Collagin Ⅲ，MMP-1，MMP-2 and MMP-9 in various groups

2.7 各组大鼠心肌中炎症因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量比较图5结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠心肌中炎症因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量明显增加（P＜0.05），IL-6含量亦增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，灯盏乙素各剂量组和阳性对照组大鼠心肌IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量均有不同程度的减少，且灯盏乙素高剂量组和阳性对照组心肌IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，灯盏乙素可减轻IHF 大鼠心肌细胞炎症反应。

图5 各组大鼠心肌细胞中IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α含量比较Figure 5 Comparison of the contents of IL-18，IL-1β，IL-6，ICAM-1 and TNF-α in rat cardiocytes of various groups

3 讨论

心力衰竭是指由于心脏的收缩功能或舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍的症候群[8]。血压和心功能相关指标均可作为衡量缺血性心力衰竭（IHF）的指标[9]。本研究结果显示，IHF 大鼠收缩压、舒张压和心率及EF、FS、E/A 明显降低，LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs 明显升高，表明IHF 大鼠出现明显的心功能障碍，这与Xing 等[5]的研究结果相一致。而灯盏乙素可明显提高IHF大鼠的收缩压、舒张压和心率及EF、FS、E/A，降低LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs，表明灯盏乙素可改善IHF大鼠的血压和心功能。

心力衰竭发生发展的病理基础是心室重构。心室重构是心力衰竭患者发病率和死亡率的决定因素，预示着心力衰竭从代偿走向失代偿[10]。心肌重构的变化包括心肌细胞的肥大、凋亡等心肌损伤。本研究观察了IHF 大鼠心肌病理形态学的HE染色结果，可见心肌细胞核严重浓缩、排列疏松、紊乱，有多处断裂、间质增宽并伴随有水肿现象，而灯盏乙素可改善IHF大鼠的上述心肌病理变化。本研究结果还显示，IHF 大鼠左心室质量/体质量明显升高，而灯盏乙素可明显降低缺血性心力衰竭大鼠的左心室质量/体质量。这都表明灯盏乙素可减轻IHF大鼠的心肌损伤，抑制心肌重构。

心肌损伤一般伴随着细胞的凋亡[11]。活化的Caspase-3能降解DNA复制相关蛋白、凋亡抑制蛋白和细胞骨架蛋白等，促使细胞凋亡[12]。Bcl-2 蛋白能够抑制细胞的凋亡，Bax 蛋白与Bcl-2 结合形成复合体，能促进Bcl-2 的降解，解除Bcl-2 对细胞凋亡抑制作用，Bax/Bcl-2 反映细胞凋亡的情况[13]。本研究结果显示，IHF大鼠心肌细胞凋亡率及心肌细胞凋亡标志蛋白cleaved Caspase-3和Bax/Bcl-2表达水平均显著增加，而灯盏乙素能够降低IHF大鼠心肌细胞凋亡率及心肌细胞凋亡标志蛋白cleaved Caspase-3 和Bax/Bcl-2 表达水平。表明灯盏乙素可能通过降低IHF大鼠心肌细胞凋亡从而抑制心肌重构。

心室重构主要由心肌间质的变化引起，心肌间质主要由胶原蛋白和糖蛋白组成，而在心肌胶原 中 Collagen Ⅰ 占 80% ～85% ， Collagen Ⅲ 占11%[14]。心室重构时，胶原蛋白会发生沉积，有效地抑制Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ沉积以抑制心力衰竭[15]。本研究结果表明，IHF 大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达水平明显上调，而灯盏乙素能够明显下调IHF 大鼠心肌Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达。基质金属蛋白酶（MMPs）是蛋白水解酶，其功能是针对胶原蛋白和间质成分的降解[16]。MMP-1、MMP-2和MMP-9在心室重塑过程发挥着至关重要的作用。既往有研究[17]表明，心室重构过程中MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 表达增强。本研究结果显示，IHF大鼠心肌MMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显上调，而灯盏乙素能够明显下调IHF 大鼠心肌 MMP-1、MMP-2 和 MMP-9 表达水平。表明灯盏乙素可调控IHF大鼠心肌间质成分的变化，抑制心肌重构。

炎症和心力衰竭紧密相关，相互促进。心力衰竭会激发心肌细胞内源性的炎症反应，并诱导释放大量的炎症因子，从而进一步引起心肌受损重构，进而加重心力衰竭[18]。已有研究发现，心力衰竭大鼠炎症因子IL-18、IL-1β、IL-6、ICAM-1、TNF-α 含量明显升高[19]。本研究结果显示，IHF大鼠炎症因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α 含量明显升高，而灯盏乙素能够明显降低IHF大鼠炎症因子IL-18、IL-1β、ICAM-1、TNF-α含量。表明灯盏乙素可能通过降低IHF大鼠炎症因子的释放从而抑制心肌重构。

综上所述，灯盏乙素可改善IHF大鼠的血压和心功能，其机制可能与降低心肌细胞凋亡、炎症反应从而抑制心肌重构有关。但其作用通路和相关分子机制还有待进一步研究。