发酵液中透明质酸含量的快速估测方法

宋 磊,刘苗苗,郭燕风,王宜磊,*

(1.菏泽学院农业与生物工程学院,山东菏泽 274000;2.山东丹红制药有限公司,山东菏泽 274000)

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种高分子酸性黏多糖,由N-乙酰葡萄糖胺与葡萄糖醛酸通过β-l,4和β-l,3糖苷键反复交替连接而成[1]。由于其独特的流变学特性、黏弹性、保湿性及良好的生物相容性,在食品、化妆品、医学领域都有广泛的应用[2-5]。微生物发酵法生产透明质酸相对于从动物组织中提取具有周期短、产量高,环境友好等优点,是目前最主要生产方法[6-9]。

发酵液中透明质酸含量检测多采用Bitter-Muir法[10-13],该方法步骤繁琐,检测时间长,误差大;从取样到检测出结果至少需要3 h。微生物发酵周期一般不超过20 h,发酵高峰期只有7～9 h,利用该方法实时监测发酵液中透明质酸含量及判定发酵终止时间没有太大指导意义。陈永浩等[14]提出CTAB比浊法快速测定摇瓶发酵液液中透明质酸,利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与HA溶液反应产生混浊的特性,通过反应体系的吸光度来反映其浊度,进而通过浊度与HA浓度的线性相关性估测发酵液中透明质酸含量。这种方法虽然在一定程度上减少了估测时间,但该方法研究取得的数据分析是基于摇瓶发酵培养,摇瓶发酵液受限于底物添加量、溶氧、pH持续降低等因素,透明质酸含量、菌体量、粘度等参数与工业生产有较大差距,因此利用此方法对企业规模化生产发酵过程中透明质酸含量估测不太准确。查阅国内外相关文献,未见有对发酵液中透明质酸含量与发酵液状态参数相偶联,通过快速检测状态参数而快速估测透明质酸含量相关报道。陈莉等[15]提出了基于BP神经网络快速估测发酵液中羊肚菌胞外多糖的含量;刘静等[16]通过测定水溶液中浊度快速估测出水中壳聚糖含量,均取得了有益的研究经验。

本文结合工厂实际生产经验,通过对透明质酸液体深层发酵过程中透明质酸含量与发酵过程中几个重要参数的相关性及变化规律分析,构建数学模型,以期能达到快速估测发酵液中透明质酸含量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵液 山东某生物工程公司提供;咔唑、氢氧化钠、亚硫酸钠、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、四硼酸钠 上海麦克林生化科技有限公司;硫酸、氢氧化钠 天津市永大化学试剂有限公司;葡萄糖醛酸、葡萄糖标准品 国药集团化学试剂有限公司。

PL203/01型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DV2TRV型旋转粘度计 美国博勒飞(广州)有限公司;WGZ-200型浊度仪 上海昕瑞仪器仪表有限公司;HK338电导率仪 北京华科仪科技有限公司;UV5800型分光光度计 上海元析仪器有限公司;H1650型离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;DZF6090型真空干燥箱 上海皓庄仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液取样 透明质酸发酵周期短,发酵过程中各参数变化快。选定从发酵开始,间隔2 h取样;取2019030901、2019031503、2019040201、2019060402、2019060501、2019060602六个发酵批次同一发酵时间节点发酵液300 mL,检测其中透明质酸、菌体量、浊度、粘度、电导率、残余糖含量。

1.2.2 菌体生长曲线及透明质酸含量变化曲线绘制 对上述六个批次同一时间节点测得菌体量、透明质酸含量取平均值,绘制曲线。

1.2.3 透明质酸含量与发酵液中各指标相关性分析 对上述六个批次同一时间节点测得透明质酸含量、菌体量、浊度、电导率、粘度、残余糖含量取均值,利用软件绘制发酵液中透明质酸含量与其他各参数相关性散点图,并根据分析结果,考察其相关性。

1.2.4 构建数学模型 筛选出与发酵液中透明质酸含量变化规律相关性显著参数,构建一元线性模型、二次项曲线模型、BP神经网络模型,用于预测未知发酵液中透明质酸含量。

1.2.5 三种数学模型预测效果比较 对2020030101、2020030203其他两个批次22个发酵液样品中透明质酸含量及相关性显著参数含量测定;利用一元线性回归、二次项曲线回归分析以及BP神经网络3种数据处理方法获得数学模型对发酵液中透明质酸含量进行估测;将实测值与模型估测值进行对比,依据试验样本方差作为3种模型的评价指标用于检验模型的准确性。方差计算公式

式中:S2表示方差;Y1表示数学模型计算值,g/L;Y2表示试验测得实测值,g/L。

1.2.6 发酵过程中各指标测定方法

1.2.6.1 发酵液中透明质酸提取纯化方法 将100 mL发酵液加入其2倍体积的酒精中,室温下搅拌后静置30 min,5400×g离心10 min,弃上清液,加400 mL纯净水溶解,升温至60 ℃,加氯化钠12 g,EDTA二钠1 g,用1 mol/L氢氧化钠调整pH至9.6,静置30 min,过滤至澄清度≥99.5,即得供试样品液。

1.2.6.2 发酵液中还原糖的测定 采用DNS法[17-18],称取6.3 g 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶于少量蒸馏水中,加入2 mol/L氢氧化钠溶液262 mL,再加入185 g酒石酸钠钾、5 g结晶酚、5 g亚硫酸钠,摇匀,冷却后定容至1000 mL棕色容量瓶中,于4 ℃冰箱中放置7 d备用。精密量取1.14 mg/mL无水葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6个20 mL具塞试管中,补充蒸馏水至2 mL混匀,加入1.5 mL DNS试液,摇匀后置沸水浴保持5 min,冷却至室温,定容至刻度,摇匀。同时,以水为空白管对照,采用分光光度计测定540 nm波长处的吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标,葡萄糖浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线。取透明质酸发酵液加纯净水适当稀释后,取溶液1.0 mL置于20 mL具塞试管中,按照上述方法测定。根据标准曲线,计算供试品中还原糖的含量。

1.2.6.3 透明质酸测定 采用Bitter-Muir法[10-13],精密量取100 μg/mL葡萄糖醛酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置于20 mL具塞试管中,各加水至1.0 mL,混匀,冰浴中冷却,并在不断搅拌下缓缓加入硼砂硫酸溶液5.0 mL,密塞,沸水浴中加热10 min,放冷。精密加入咔唑溶液0.2 mL,摇匀,沸水浴中加热15 min,放冷。在530 nm波长处测定吸光度,以葡萄糖醛酸对应的吸光度计算回归方程(回归相关系数>0.999)。精密量取供试品溶液1.0 mL置于具塞试管中,按照上述方法,测定吸光度,从标准曲线上查出相应的葡萄糖醛酸含量。根据理论计算,HA分子中葡萄糖醛酸的含量为46.32%,故可根据葡萄糖醛酸含量除以46.32%即得HA含量。

1.2.6.4 发酵液粘度测定 采用数显旋转粘度计测定:控温25 ℃,根据不同粘度,选择合适转子及转速测定读数。

1.2.6.5 电导率 控温25 ℃,采用电导率仪测定。

1.2.6.6 浊度 对发酵液稀释10倍后,采用浊度仪测定。

1.2.6.7 发酵液中菌体含量的测定 采取干重法[19],根据透明质酸发酵液粘度液稀释至1000 mPa·s以下后离心取沉淀,洗涤一次,60 ℃真空干燥至恒重,称取质量计算细胞浓度。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据统计;SPSS 19.0软件用于相关性分析、偏相关分析、一元线性模型及二次项曲线模型构建;Matlab2014软件用于构建BP神经网络模型;采用Orgin 9.1软件进行绘图。对六个批次发酵液测得各参数数据取均值用于相关性分析;六个批次各参数测得全部数据构建数学模型。

2 结果与分析

2.1 菌体生长曲线及透明质酸含量变化曲线

对六个批次同一时间节点测得菌体量、透明质酸含量值取平均值,绘制曲线。结果如图1、图2所示。

图1 菌体生长曲线

图2 透明质酸含量变化曲线

从图1可知,0～2 h为菌体生长的调整期,菌体量很少;2～10 h为对数生长期,菌体快速生长繁殖;10～18 h菌体进入稳定期,菌体量始终保持在高位;18 h后进入衰亡期,菌体开始自溶。从图2可以看出,0～6 h透明质酸产量很少;6～16 h透明质酸快速积累;18 h后细胞生长进入衰亡期,菌体开始裂解,逐渐释放透明质酸酶,致使透明质酸开始降解,产量下降。

2.2 透明质酸含量与发酵液各参数相关性分析

由图3可以直观地看出,发酵液中透明质酸含量与还原糖含量、粘度相关、菌体量存在一定相关性,与电导率、浊度相关性不显著。经Pearson相关检验分析,表1给出了透明质酸含量与菌体量、浊度、粘度、电导率、残余还原糖含量各参数之间的相关性系数及检验显著性水平。发酵液中透明质酸含量与发酵液浊度、电导率相关显著性水平分别为0.081、0.192,均大于0.05,表明发酵液中透明质酸含量与发酵液浊度、电导率变化不存在相关性;发酵液中透明质酸含量与发酵液中菌体量、粘度、残余还原糖变化显著性水平分别为0.001、0.000、0.000,远小于0.05,表明发酵液中透明质酸含量与发酵液中菌体量、粘度、残余还原糖显著性相关。

表1 透明质酸(HA)与各参数相关系数及显著性水平

图3 透明质酸(HA)与各参数相关性散点图

单纯利用相关系数来评价变量间的相关性还不够准确,还需要在剔除其他相关因素影响的条件下,计算变量间的偏相关系数[15]。经偏相关分析,结果见表2。控制粘度及残余还原糖含量两个变量,透明质酸含量与菌体量相关性系数为0.137,显著性水平为0.725,远大于0.05,表明两者存在虚假性相关。控制其他两个变量,透明质酸含量与粘度、残余还原糖变化规律呈显著性相关,相关系数分别为0.984、-0.869,显著性水平均小于0.01。这是由于发酵液中葡萄糖除了少部分用于菌体生长繁殖外,绝大部分用于合成透明质酸。其流程是葡萄糖经糖酵解(EMP)途径形成6-磷酸果糖,然后在酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖胺,进而合成交替地将尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖;尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸是通过糖醛酸途径合成。菌体中透明质酸分子链的延长是从内源非还原端进行,透明质酸合成酶交替地将尿苷二磷酸-N-酰基-氨基葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸以每分钟约100个糖单位的速度快速添加到HA分子链上,同时逐渐增长的HA链会穿过质膜被送到胞外基质中[20]。故发酵液中透明质酸含量与还原糖含量变化表现出较强的相关性;透明质酸水溶液由于其分子内和分子间的作用,具有非牛顿流体的流变学特性及粘弹性。当透明质酸的浓度较低,溶液的粘度随浓度变化相对较小,但浓度达到某一阈值时,溶液的粘度随浓度的增加而快速提高,并表现出很强的的正相关性。结合两变量相关性及偏相关分析,可用发酵液粘度与发酵液中残余还原糖来描述预测发酵液中透明质酸含量,其中透明质酸与发酵液粘度在相关性与偏相关性更强,显著性水平更低;此外考虑到发酵液粘度检测可通过旋转粘度计直接读数,方法简单;发酵液中还原糖含量检测步骤繁琐、时间长情况,选定发酵液粘度最为描述发酵液中透明质酸含量变化的唯一变量。

表2 透明质酸(HA)与各参数的偏相关系数

2.3 构建数学模型

取六个发酵批次66组实验数据用于数学模型的构建,采用SPSS 19.0进行一元线性回归和二项式曲线回归分析;matlab2014构建BP神经网络模型。公式中Y代表发酵液中透明质酸含量,X代表粘度。

2.3.1 一元线性回归 对33组试验数据进行一元线性回归分析。结果如下:

Y=0.641+0.076X

经分析得,该线性方程复相关系数为0.993,判定系数R2为0.986,接近于1,初步表明拟合效果较好;模型残差进行独立性检验,DW=0.653,查询Durbin Watson table可以发现本例DW值恰好出在无自相关性的值域之中,认定残差独立,通过检验;回归方程显著性检验的概率P=0.000<0.01,表明由自变量“粘度”和因变量“透明质酸含量”建立的线性关系回归模型具有显著的统计学意义。

2.3.2 二次项曲线回归分析 二次项曲线回归分析模型为:

Y=0.404+0.108X-0.00025X2

经分析得,回归方程显著性检验的F值为327.6,判定系数R2为0.995,回归方程显著性检验的概率P值为0.000,说明模型高度显著。

2.3.3 BP神经网络 BP神经网络是一种按误差反向传播训练的多层前馈网络,具有很强的非线性映射能力,能很好地应用于非线性预测问题[21-23]。取上述66组实验数据构建三层结构BP神经网络[24-26],输入层、输出层各一个神经元,分别代表发酵液粘度和发酵液中透明质酸含量,输入层到隐含层的传递函数为logsig函数,隐含层到输出层之间选择purline线性传递函数。网格训练函数采用应用Levenberg-Marquardt优化后的trainlm训练函数算法。经多次试错法训练选择最佳隐含层神经元个数为10个,训练13次后平均R值为0.9996。

2.4 三种数学模型预测效果比较

对2020030101、2020030203其他两个批次22个实验样本进行发酵液粘度及发酵液中透明质酸含量检测;依据发酵液粘度值利用一元线性回归、二次项曲线回归分析以及BP神经网络3种数据处理方法获得数学模型对发酵液中透明质酸含量进行估测;将实测值与模型估测值进行对比,实验样本方差作为3种模型的评价指标检验模型的准确性,结果如表3所示。

表3 三种模型检验结果

由表3可知,利用BP神经网络模型的检验方差值最低为0.0189,表明利用BP神经网络建立模型依据发酵液粘度对发酵液中透明质酸含量预测准确率最高,其次是二次项曲线回归分析模型,一元线性回归模型的准确率最低。

3 结论

在透明质酸发酵工业中,实时了解发酵液中透明质酸含量,对掌握发酵过程状况、判定发酵终止时间、提前准备后续分离纯化工作有很大的指导意义,找到一种准确快速估测发酵液中透明质酸含量的方法显得尤为重要。通过对发酵液中透明质酸含量与菌体量、浊度、粘度、电导率、残余糖含量变化规律的相关性分析,发现发酵液的浊度、电导率与透明质酸含量之间几乎不存在相关性,发酵液中菌体量、粘度、残余还原糖与发酵液中透明质酸含量变化相关性显著,相关系数均在0.8以上。继续偏相关分析,发酵液中菌体量与发酵液中透明质酸含量存在虚假相关,发酵液粘度与发酵液中残余糖含量可作为描述发酵液中透明质酸含量的参数。考虑到发酵液中透明质酸含量与粘度相关性最为显著且检测方法简单,选择发酵液粘度作为描述发酵液中透明质酸含量的唯一参数。对构建一元线性回归、二次项曲线回归分析以及BP神经网络3种数据处理方法获得的数学模型进行验证分析,三种模型根据发酵液粘度预测实验结果方差分别为 0.2481、0.0646、0.0189,其中BP神经网络预测效果最为准确。利用BP神经网络构建数学模型只需将发酵液粘度代入模型即可准确快速测定透明质酸含量,从取样到获得结果,不超过20 min,极大缩短了检测发酵液中透明质酸所需时间,对实时监测发酵液中透明质酸含量及判定发酵终止时间有重要意义。此文利用BP神经网络构建模型只取了六个批次66组实验数据,如能增大实验样本数量,重构的数学模型对实验结果预测会更加精确;此外发酵液中粘度、还原糖含量均与透明质酸含量表现出了强烈的相关性,发酵液粘度和还原糖含量是否存在相关性,利用粘度是否可预测发酵液中残余还原糖含量有待进一步研究。