超高效液相色谱串联质谱法测定保健酒中紫杉醇的含量

杨晓聪,刘正才,,*,吕佳乐,林永辉,王丹红,姚闽娜

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福州海关技术中心,福建福州 350001;3.福州广电计量检测有限公司,福建福州 350001)

紫杉醇(Paclitaxel)是从紫杉树皮中分离提取的二萜类天然化合物,可作用于微管蛋白,使其结构和功能发生改变,从而抑制肿瘤细胞繁殖,因此具有独特的抗肿瘤作用[1]。红豆杉是世界上公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物,也是紫杉醇提取分离的唯一来源。目前已从红豆杉属植物分离鉴定出20余种黄酮类及双黄酮类功效成分化合物,并被广泛应用于医药、食品等行业[2],另外由于红豆杉中可提取“紫杉醇”并用于治疗癌症,因此有很多人用红豆杉果、树皮、木片为原料制作红豆杉保健酒[3]。红豆杉保健酒含有的紫杉醇具有骨髓抑制、神经毒性、心脏毒性、肝脏毒性,大量服用会有抑制骨髓造血功能、白细胞下降等副作用[4-6],红豆杉泡酒导致中毒的事故时有发生。原国家卫生部下发的《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》里已经将红豆杉列入保健品禁用物品名单,禁止将红豆杉作为保健食品和食品原料使用。而目前对市场上非法销售的红豆杉酒的鉴定只是从标识和外观上进行简单的识别,尚未有科学的鉴定方法,故在监管上存在一定程度的漏洞,让不法商家有机可乘,为保健酒的安全埋下了隐患。因此,除了各地卫生部门要加大监督检查力度,严肃查处生产经营含红豆杉食品的行为外,开发相关的检测和鉴定方法也是十分必要的。

常用紫杉醇的检测方法有分光光度法[7]、高效液相色谱法[8-10]、液相色谱-质谱联用法[11-14]等。分光光度法在实际检测过程中由于色素等杂质干扰导致定量准确性差、重现性低;高效液相色谱法对分离度要求高,分析时间较长;液相色谱-质谱联用法由于高通量、高选择性的优势,已成为分析检测紫杉醇化合物的主要手段。目前紫杉醇的分析主要集中在紫杉醇药用研究[15-18]、提取与合成生产研究[19-24]、以及生物制品上的检测[25-29],尚未发现保健食品中紫杉醇含量测定的研究。

本文选取紫衫烷中最常见的紫杉醇为研究对象,并对净化条件和质谱、色谱检测条件进行优化,建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定保健酒中紫杉醇的含量,该方法灵敏度高、选择性好、结果准确可靠,可对保健酒的风险评估和检测提供一定的参考依据,为识别和鉴定红豆杉保健酒提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆杉材料(根、茎、叶、果) 福建省宁德市古田县卓洋乡杉洋镇红豆杉林(海拔800 m);实验用中药材浸泡保健酒、红豆杉果酒 福建省食品药品检验研究院日常抽检产品;紫杉醇对照品(CAS No.:33069-62-4) 纯度大于98.0%,北京中科质检生物技术有限公司;乙腈、甲醇、丙酮 色谱纯,Fisher Scientific科技公司;甲酸 色谱纯,德国Merck公司;实验用超纯水 美国Milli-Q超纯水系统。

API5500超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Biosystems公司;XK80-A旋涡混合器 江苏新康医疗器械有限公司;HN200多功能氮吹仪 济南海能仪器股份有限公司;Milli-Q纯水系统 美国Millipore公司;石墨化炭黑固相萃取小柱250 mg/3 mL 德国CNW科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 称取紫杉醇对照品约5 mg,用甲醇溶解配制成质量浓度为100 μg/mL标准储备液,于-20 ℃避光储存。移取1 mL标准储备液于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配制成质量浓度为1 μg/mL标准工作液,再根据需要配制成相应浓度的标准曲线。

1.2.2 供试品溶液的制备 移取1 mL保健酒样品,置于10 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀后移取1 mL至预先用3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)和3.0 mL甲醇活化的石墨化炭黑固相萃取小柱中,再用3.0 mL水和3.0 mL甲醇-水溶液(50∶50,V/V)分别淋洗,弃去流出液,移取3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)进行洗脱,收集洗脱液,于45 ℃下用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 mL甲醇-水(5∶5,V/V)溶解残渣,过0.22 μm有机滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 质谱条件 电离模式:电喷雾电离正离子模式;检测方式:多反应监测(MRM)模式;紫杉醇母离子m/z 854.5;定量离子m/z 286.0,碰撞能量25 eV;定性离子m/z 569.3,碰撞能量15 eV;去簇电压100 v;离子源喷雾电压(Ionspray Voltage):5000 v;气帘气压力(Curtain Gas):0.275 MPa;离子源温度(Temperature):500 ℃;雾化气压力(Gas 1):0.345 MPa;加热辅助气压力(Gas 2):0.345 MPa。

1.2.4 液相色谱条件 色谱柱:Luna® C8100A(150 mm×2 mm,3 μm);柱温:40 ℃;流动相:A为0.2%甲酸水溶液,B为乙腈;梯度洗脱程序:0～5 min,15% B线性升至90% B;5～7 min,90% B不变;7～8 min B线性降至15%,保持2 min。流速:0.3 mL/min。进样量:5 μL。

1.3 数据处理

实验结果采用Excel 2010软件、Origin 8.0软件和ChemDraw 18.0软件进行绘图和处理。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

以针泵进样的方式把紫杉醇标准液注入质谱仪中优化质谱条件。首先确定母离子和选择离子检测模式,分别考察了紫杉醇在正、负离子模式下检测的响应情况,发现紫杉醇在ESI正、负离子模式扫描都能出峰,ESI负离子模式时母离子为m/z 852.5,ESI正离子模式时有加氢离子峰m/z 854.5和加钠离子峰m/z 876.4,经MRM模式测试,m/z 854.5的响应值明显高于m/z 852.5和m/z 876.4,且m/z 876.4出峰不稳定,因此本实验选择ESI正离子模式,母离子为m/z 854.5。确定目标母离子后,再对母离子施加一定的碰撞能量,使其产生特定的子离子,然后优化各化合物二级质谱的源内碎裂电压、碰撞气能量(CE)等参数,得到二级质谱图(见图1)。

图1 紫杉醇标准品的二级离子碎片扫描质谱图以及可能的裂解方式

2.2 色谱条件的选择与优化

2.2.1 色谱柱的选择 紫杉醇是一种含五甲基十五碳烯骨架的二萜类化合物,极性较弱,在以弱极性或非极性固定相的反向色谱柱中均有较好的保留,本实验重点比较了紫杉醇在不同型号C18和C8色谱柱上的保留情况,实验考察了Luna® C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)、Luna® C18(150 mm× 2 mm,3 μm)和具有核-壳技术的Kinetex® C18(150 mm×2 mm,2.6 μm)3种色谱柱的分离效果(见图2),结果表明,紫杉醇在Luna® C18柱上峰型较宽,Kinetex® C18柱上峰型窄,但前端有小的分叉峰,因此选择Luna® C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)色谱柱作为分析柱,没有杂质干扰且峰型较好。

图2 紫杉醇在不同色谱柱上的分离效果图

2.2.2 流动相的优化 分别考察了以乙腈-水、甲醇-水作为流动相的测定结果,结果表明,以乙腈/水为流动相时,质谱信号较好。又考察了当使用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-5 mmol/L乙酸铵含0.2%甲酸溶液作为流动相时紫杉醇的分离和响应情况(见图3)。试验结果表明,流动相中加酸有改善峰型,增强响应值的作用;加入少量的乙酸铵对紫杉醇的响应值影响不大,甚至有抑制作用。为取得较高的灵敏度,选择乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相,同时采用梯度洗脱法取得了较好分离效果。

图3 紫杉醇在不同流动相的分离效果图

2.3 样品前处理

由于保健酒中通常含有30%～60%的乙醇,而乙醇对紫杉醇有很好的溶解性,除此之外,保健酒当中的色素、糖类、中药成分在提取过程中可能会被一同提取出来[30-31],污染色谱和质谱系统的同时也会对试验结果造成极大的干扰,因此必须选择合适的净化方法。试验采用移取相同体积的空白基质配制200 ng/mL的紫杉醇标准溶液,分别用SPE(C18小柱和石墨化炭黑柱)净化、QuEChERS净化以及直接稀释进样法这四种净化方法净化后测定,考察不同净化方法对响应值的影响(见表1)。结果表明,C18柱净化时易堵塞,流速慢,耗时最长;QuEChERS净化回收率偏低,重复性差;直接稀释进样法对色谱柱不利,且不能去除大部分色素;GCB柱是去除色素时常用的小柱,且能用低沸点的丙酮-二氯甲烷洗脱目标物,有利于后续氮吹浓缩步骤,提高检测效率,实验采用先稀释10倍降低样液中乙醇的比例,再用石墨化炭黑柱净化,取得了较好的效果。

表1 紫杉醇在不同净化条件下的净化回收率(n=4)

2.4 基质效应考察

保健酒基质中含有色素、中药类和糖类等成分,基质成分较为复杂,因此需要考虑消除基质效应所带来的影响。根据Matuszewski等[32]的研究,本试验采用阴性药酒来配制基质匹配标准曲线(0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 5个标准系列),用定容液配制同等浓度的标准曲线,以基质匹配标准曲线与标准曲线的斜率之比来考察化合物的基质效应。实验结果表明保健酒中紫杉醇曲线比值为90.5%,基质抑制率为9.5%,而一般认为,基质曲线响应值与其标准曲线响应值的比值在85%～115%之间时不存在基质效应,因此基质对目标物质定量影响不大,本方法可以不考虑基质效应对定量的影响。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系 按本文方法配制一条系列质量浓度的混合标准溶液,在选定的色谱和质谱条件下测定后进行标准曲线的绘制。以目标组分峰面积(y)对目标组分的质量浓度(x,μg/L)作线性回归分析,得到线性范围、线性方程和相关系数。结果表明,紫杉醇在1～100 μg/L线性范围内线性关系良好,计算得回归方程y=474.63x+1.10×103,决定系数(R2)为0.9994,适合定量分析。

2.5.2 检出限与定量限测定结果 在保健酒空白样品中加入不同量的紫杉醇标准品后,稀释后进行测定,对紫杉醇的检出限和定量限进行评估,以3倍信噪比(S/N=3)为检出限(LOD),计算检出限为3.0 μg/L;以10倍信噪比(S/N=10)为定量限(LOQ),计算定量限为10.0 μg/L。

2.5.3 回收率和精密度 取空白保健酒作为添加回收试验的基质,进行添加回收率和精密度的试验。加标水平分别为10.0、50.0、100.0 μg/L,按1.2.2节进行样品前处理,在1.2.3节和1.2.4节的条件下进行测定,每个加标水平做6组平行试验。结果见表2,紫杉醇在10.0、50.0和100.0 μg/L 3个水平下的平均加标回收率为88.9%～92.4%,相对标准偏差(RSD)为7.8%～9.5%。

表2 保健酒中紫杉醇药物在3个加标水平下的回收率(n=6)

2.6 实际样品测定

应用本文所建立的方法,对15批市售含有枸杞、人参、葛根、桂圆等中药材浸泡保健酒样品中紫杉醇进行测定,均未检出;从淘宝网上购得2批次红豆杉果酒,均有检出紫杉醇,且含量均超过方法定量限的100倍以上,其结果见表3,说明该方法特异性强,能够简单有效识别保健酒中非法使用红豆杉的行为;同时为了解用红豆杉不同部位泡制的保健酒中紫杉醇的溶出情况,分别取红豆杉的根、皮、果、叶各10 g,分别装入250 mL的棕色容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,密封避光浸泡30 d后,摇匀,分别取适量上清液用0.45 μm滤膜过滤,再用水稀释20倍,然后移取1 mL过GCB柱净化,UPLC-MS/MS分析,其结果见图4,实验表明,红豆杉的根、皮、果、叶泡酒均会浸出大量的紫杉醇,根部浸泡出的紫杉醇含量最高,风险最高,而叶子含量最低,该结论与文献[33]报道一致。

图4 红豆杉中不同部位浸泡出紫杉醇的含量(浸泡液70%甲醇)

表3 市售17批保健酒样品信息以及紫杉醇含量测定结果(n=3)

3 结论

通过色谱质谱条件、前处理条件和SPE条件的优化,建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健酒中紫杉醇含量的方法。该法简单、快速、灵敏度高,通过SPE的净化可以去除大部分色素等杂质,方法特异性强、干扰因素少,可满足复杂基质保健酒中紫杉醇含量测定的要求。该方法的建立对保健酒中紫杉醇的检测提供依据,同时也对保健酒的风险监测和评估具有重要的意义。