复合酶催化强化浸提桑叶黄酮类物质研究

詹 力,王星敏,2,*,唐付杰,李仁炳

(1.重庆工商大学环境与资源学院,重庆 400067;2.重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心,重庆 400067)

黄酮类化合物属植物次生代谢产物[1],作为功能成分广泛应用于药物、保健食品及化妆品开发等。药食同源物桑叶含有黄酮类、生物碱类、多糖类等[2]成分,而芦丁、异槲皮苷、紫云英苷是桑叶黄酮类物质的代表,具有降血压[3]、抗氧化[4]等药理活性,临床上用于高血压病及糖尿病的辅助治疗[5]。现有桑资源黄酮类物质开发利用技术包括有机溶剂提取法、微波辅助法、超声提取法、酶提取法及超临界萃取法等[6],孙莲等[7]采用超声波提取桑叶中黄酮类物质,测得芦丁含量1.01 mg/g、异槲皮苷0.74 mg/g、紫云英苷0.23 mg/g;邸学等[8]采用有机溶剂萃取法检测到桑叶中芦丁含量0.13 mg/g、异槲皮苷0.21 mg/g、紫云英苷0.07 mg/g。分析提取黄酮类物质发现,有效成分存于细胞原生质体中,需克服细胞壁及细胞间质双重阻力,才能扩散至提取介质中[9];致密的植物细胞壁组织结构形成的天然屏障[10],阻碍异槲皮苷等黄酮类天然活性物质的溶出。酶解法具有高效及专一性,选取植物组织特定酶,可催化降解木质素、纤维素、半纤维素等细胞壁组成成分,从而减少天然成分溶出的传质阻力,提高天然产物提取量[11]。如李侠等[12]应用超声-纤维素酶法提取绿豆皮黄酮类化合物,得率可达到0.831%,比单独超声波提取的得率提高了18.54%;李艳凤等[13]利用复合酶(纤维素酶、果胶酶及半纤维酶)酶解提取银杏叶中黄酮类化合物发现,适宜条件下复合酶对银杏叶的细胞组织有较强的破壁力,总黄酮提取率比不加酶提高了36.6%。如何增大植物细胞的破壁能效、提高有效成分的溶出效率,进而实现桑资源的高效利用,对提升桑蚕业的整体效益和持续发展尤显重要。

基于此,本文提出复合酶催化酶解桑叶植物组织强化浸提天然活性物质,选取黄酮类物质异槲皮苷溶浸量为评价指标,采用均匀设计法优化获得异槲皮苷的适宜溶出参数,探究复合酶催化水解植物组织及其对黄酮类物质破壁溶出作用,为实现桑资源开发利用最大化提供技术研究及理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干桑叶粉 采摘自重庆市北碚区蚕桑研究院;乙腈(色谱纯) 重庆川东化工集团有限公司;芦丁(标准品)、异槲皮苷(标准品)、紫云英苷(标准品) 成都普菲德生物技术有限公司;纤维素酶(100 U/mg) 和氏璧生物科技有限公司;半纤维素酶(20 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg) 上海源叶生物科技有限公司;漆酶(10 U/mg) 北京酷尔化学科技;无水乙醇、柠檬酸、磷酸(分析纯)、溴化钾(色谱纯) 重庆川东化工集团有限公司。

1260高效液相色谱仪 美国贝克曼库尔特有限公司;pH计 上海雷磁精密仪器有限公司;TDZ5-WS高速离心机 上海君竺仪器制造有限公司;EL104电子天平(0.0001 g) 塞多利斯科学仪器有限公司;Nexus 670傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合酶设计及酶解反应 称取过60目筛的干桑叶粉2 g于锥形瓶中,加入分配比为漆酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白质量比为2∶1∶1∶26的复合酶,按体积比为1∶5加入无水乙醇10 mL及蒸馏水50 mL后,用质量浓度为0.5 g/mL的柠檬酸溶液调节pH,混匀后于一定温度水浴酶解一段时间后,取出冷却至室温,过滤、离心(4000 r/min,10 min)、定容于100 mL得酶解提取液,待测。其中,复合酶组配根据预实验结果、采用均匀设计法优化获得。

1.2.2 黄酮类物质含量测定 采用高效液相色谱法测定酶解提取液或乙醇浸提液中黄酮类物质的质量浓度,色谱柱为Agilent TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为体积比为20∶80的乙腈和0.5%磷酸溶液,流速为1 mL/min[14],检测波长为358 nm,柱温为25 ℃,进样量为10 μL。绘制桑叶异槲皮苷、芦丁及紫云英苷的标准曲线分别为:Y=18597X-5.827(R=0.9994)、Y=20400X-20.394(R=0.9995)、Y=13147X-21.014(R=0.9985)。根据标准曲线计算异槲皮苷、芦丁、紫云英苷的溶出质量浓度,进而计算桑叶黄酮类物质溶浸量,计算公式如下:

式(1)

式中,A为黄酮类物质溶浸量,mg/g;c为各黄酮类物质溶出浓度,g/L;v为提取液体积,mL;m为桑叶质量,g。

1.2.3 单因素实验 根据预实验结果,考察酶解时间(水平值为30、45、60、90、120、150、180 min)、酶解温度(水平值25、30、35、40、45、50、55 ℃)、复合酶投加量(水平值为0.150、0.225、0.300、0.375、0.450、0.525、0.600、0.675、0.750 g)及pH(水平值为4.0、4.3、4.6、4.9、5.2、5.5、5.8)对异槲皮苷、芦丁、紫云英苷等黄酮类物质的溶浸量的影响,并选取异槲皮苷溶浸量为评价指标,确定考察因素的适宜范围值。其中,各因素的初始值为酶解时间60 min、酶解温度35 ℃、复合酶投加量0.3 g、pH4.5,其余参数值按1.2.1选取。

表1 均匀设计因素水平与编码

1.2.5 无酶乙醇溶浸 溶浸工艺中复合酶投加量为零,反应时间、水浴温度、pH为均匀设计法优化所得酶解反应得适宜参数,其余参数与1.2.1中参数一致。

1.2.6 物相表征

1.2.6.1 扫描电子显微镜分析 扫描电子显微镜(SEM)是用细聚焦的电子束扫描样品,样品与电子束之间相互作用会产生大量二次电子,利用二次电子信号成像观察样品表面及断口形貌并对此进行分析[15]。本试验采用SEM法分析经酶解催化反应前后桑叶表面物相结构,其中电镜工作电压为15 kV、放大1250倍。

1.2.6.2 桑叶底物表面官能团FTIR分析 采用衰减全反射模式测定桑叶的傅里叶变换红外光谱,分析酶解反应后底物表面化学物质的官能团种类及其变化,测定波数为4000～500 cm-1。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,结果取平均值并计算标准误差,运用Origin 8.5软件绘制趋势曲线图。利用SPSS 19.0(statistical product and service solutions)软件和VF 6.0(visual foxpro)软件分析实验数据,建立模型,计算获得优势酶解参数。

2 结果与分析

2.1 影响黄酮类物质溶出的酶催化因素解析

2.1.1 酶解时间对黄酮类物质溶浸的影响 酶催化活性中心与底物的接触受酶解时间影响[16]。由图1可知,三种黄酮类物质的溶浸量随酶解时间先升后降,异槲皮苷、芦丁在60 min时均达到最大值0.49、0.29 mg/g,紫云英苷在此时也有极大值0.50 mg/g。分析其原因可能是反应初期,随着酶逐步与底物充分接触,酶解破壁效率逐步提高,黄酮类物质溶浸量呈上升趋势;随着复合酶活性中心都被底物结合充分发挥了催化酶解作用,进而酶解效率逐渐趋于平缓[17];结合文献对比复合酶酶解时间仅为单一酶(纤维素酶)[18]的12.5%。

图1 酶解时间对桑叶黄酮类物质浸提量的影响

2.1.2 酶解活化温度对黄酮类物质的影响 复合酶作为蛋白质,对温度表现敏感。由图2可知,三种黄酮类物质溶浸量随着反应温度的升高逐渐增加,在50 ℃时表现出最适宜温度;此时异槲皮苷、芦丁、紫云英苷溶浸量分别为0.89、0.50、0.57 mg/g。分析原因在于,在酶适宜温度45～65 ℃的范围内,温度升高,活化分子数会相应增多,进而提高酶活性,促进酶解活化反应;温度升高,天然活性物质分子运动速度虽加快,有利于活性物质的渗透、扩散、溶解[19],但酶随温度热变性同时加快,酶活力减小,导致天然活性物质溶出量降低[17]。

图2 酶解温度对黄酮类物质浸提量的影响

2.1.3 复合酶投加量对黄酮类物质的影响 酶的投加量也影响单位体积酶活性中心数,进而影响单位时间酶反应速度。由图3可知,当复合酶投加量由0.15 g增至0.6 g时,芦丁溶浸量也迅速增加,最高可达0.67 mg/g;而异槲皮苷和紫云英苷酶催化溶出优势明显,分别在0.45 g出现最大溶浸量,但继续增加复合酶投加量黄酮类物质并不更多溶出。分析原因,酶投加量的增加,加大了与底物接触的酶活性位点[10];但随着酶投加量的不断增加,同时加大反应体系中其他天然产物的溶出竞争,影响异槲皮苷和紫云英苷的优势溶出。

图3 复合酶投加量对黄酮类物质浸提量的影响

2.1.4 pH对黄酮类物质的影响 酶蛋白分子表面极性基团随体系pH的变化而发生不同程度的解离,影响酶活性部位构象[18]。由图4可知,异槲皮苷、芦丁和紫云英苷溶浸量随体系pH的增大呈先增加后减小再增加再减小的波动趋势,当pH为4.3时,三种黄酮类物质均达最高溶浸量,分别为1.67、0.70、0.81 mg/g。分析原因在于,本实验的复合酶虽主要为木瓜蛋白酶,其最适pH范围5～7,但其中少量的漆酶、纤维素酶及半纤维素改变了整个复合酶制剂的最适pH。溶液pH改变会破坏酶的空间结构且失活,影响酶活性中心催化基团的功能,从而影响植物细胞的破壁作用,及酶解反应的速率和酶解效率[20-21]。

图4 pH对黄酮类物质浸提量的影响

2.2 酶解反应提取异槲皮苷的适宜工艺条件的探索

表6 黄酮类物质的不同浸提方法优势比较

表2 均匀设计实验结果

表3 回归分析方程结果

表4 显著性分析结果

表5 验证结果

2.3 复合酶催化强化作用解析

2.3.1 桑叶底物表面官能团结构分析 谷绪顶等[23]采用红外光谱图解析植物底物表面官能团,证明微生物预处理破坏桑叶细胞壁,利于细胞中1-脱氧野尻霉素的释放;何士成等[24]也通过FTIR图谱表明,经碱液处理后,柠条、水稻秸秆和小麦秸秆的木质素结构受到一定程度的破坏。因此本文采用红外光谱分析酶解反应后底物表面化学物质的官能团种类及其变化,如图5所示,经过酶解后的桑叶残渣在2920 cm-1处的吸收峰增强,为C-H伸缩振动[25],说明酶解作用破坏了植物组织使得更多的胞内物质溶出;桑叶的红外谱图中位于1390 cm-1是源于纤维素中的葡萄糖和半纤维素中木聚糖结构分子上的-CH2与O-H的弯曲振动的吸收峰[26],同样酶解后的样品在此处特征峰增强,说明复合酶中半纤维素酶作用于半纤维素使其发生分解,半纤维素与木质素之间的交联结构被破坏。在2330、1564及1133 cm-1处的特征吸收峰分别是-C≡C-、>C=C<以及羧基的C-O的伸缩振动[25],表明酶解反应促进桑叶木质素中苯基丙烷结构单元分解,有利于桑叶植物组织中空隙的形成。酶解反应前后桑叶底物红外谱图反映出复合酶制剂在反应过程中对桑叶结构的破坏,即酶解反应对活性物质溶出的促进作用。

图5 桑叶底物红外光谱分析

2.3.2 桑叶植物组织结构形貌分析 实验采用SEM法对比未经处理和经酶解活化反应后的桑叶粉末残渣的表面物相结构变化,结果如图6所示。由图6(a)可知,未经处理的桑叶结构完整致密,图6(b)可知经酶解活化后的桑叶表面受到一定程度的破坏,组织结构疏松空隙明显增大,且出现众多孔洞,说明复合酶对植物组织有破壁作用,新增的不规则空隙减少天然产物溶出的阻力,进而提高其溶浸量。

图6 桑叶SEM扫描图片

2.3.3 黄酮类物质破壁溶出作用解析 经过均匀设计优化得到的适宜酶解浸提条件下逐次增大反应底物的量由A1到A7(1,2,3,4,5,6,7 g),以期找到该条件下一定量复合酶的最大破壁效率。以各黄酮类物质的浓度增量为纵坐标,参加反应的底物增量为横坐标绘制趋势变化图,实验结果如图7所示。由图知各黄酮类物质在A5-A4点之前的增量趋势线都是呈上升,说明该点为复合酶酶解破壁的最大效用点,即0.675 g复合酶在35 ℃下、30 min内对4 g桑叶粉进行酶解破壁作用效果最好。而后面两个点的增量仍不稳定,甚至在A7-A6点处出现了骤然上升的趋势,这是因为此类天然活性产物极性较大,通过相似相容原理也能被反应体系中乙醇部分溶出[27]。所以针对酶解破壁的效率来说,此酶解条件下最佳酶料比为0.169∶1,复合酶能够高效快速的破坏细胞壁,使细胞质溶出,分解蛋白质、淀粉和果胶等杂质,提高目标成分的提取效率[28]。

图7 黄酮类物质溶浸随底物质量变化的影响

3 结论