红芪加工废弃物活性多糖对果蝇寿命和抗氧化能力的研究

叶文斌，何玉鹏，宫峥嵘，陈耀年

(1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院，甘肃 成县 742500；

2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县 742500；

3.甘肃省农业固体废弃物资源化利用重点实验室，甘肃 天水 741000)

中国是世界上农业废弃物产出的最大国家，随着农业经济的不断发展，农业种植物的固体废弃物也随之增加[1-2].近年来随着国家对中药材种植的政策支持，甘肃省大力实施陇药振兴计划，明确支持建立中药材生产基地，陇南道地中药材红芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)是主要的支持和推广种植栽培品种，近3年光陇南红芪种植面积已达6.7万hm2以上，采挖面积4 000 hm2以上，年产量超过200万t，产值达2亿元以上，陇南已成为中国最大的红芪生产、加工和销售基地[3]，由于红芪采挖和加工时会产生数量巨大的加工废弃物，而这些加工废弃物中主要有根、须、头和加工时折断的残渣，而这些残渣在加工后不能及时处理，在堆积一段时间后当作废弃物废弃或堆入田间用作肥料，大大的浪费了红芪资源，所以如何对红芪加工废弃物的无害处理和高效资源化利用研究是当前面临的一个主要问题.陇南武都红芪为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪变种的干燥根，性温，味甘，具有补气固表、利尿解毒、排脓、敛疮生肌等功效[4]，以陇南市武都米仓山特产尤为著名，是中国国家地理标志产品，其主要成分为红芪多糖，占红芪总成分的23%～34%[5].中药类多糖具有众多的生理功能使其成为国内外研究的热点，红芪多糖同其它药用植物多糖一样，具有广泛的药理作用，尤其在改善动物脑缺血的脑损伤和再灌注后脑组织神经元结构功能的保护[6-7]、急性心肌梗死大鼠心肌氧化损伤的修复、糖尿病心肌病心肌纤维化抑制和心肌组织氧化应激损伤的修复[8-10]、口腔癌细胞的抑制具有很好的作用[11]，而且具有依赖性低、毒副作用小、安全性高、疗效好等特点[12-15].用红芪加工废弃物活性多糖对黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)寿命和抗氧化能力的研究报道较少.

本文以黑腹果蝇为材料，采用生存试验及统计分析方法研究和探讨红芪加工废弃物活性多糖对果蝇寿命和抗氧化能力进行评价，为开发无毒无副作用的抗氧化、抗衰老替代药物和功能食品提供依据，也为红芪加工废弃物的再利用和综合开发利用提供技术.

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要仪器

黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)，由天水师范学院遗传学实验室提供；红芪加工废弃物活性多糖主要成分为红芪多糖，纯度为99.38%，陇南师范高等专科学校农林技术学院实验室提供；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20160822)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(批号20170509)、MDA试剂盒(批号20170729)均购自南京建成生物工程研究所；酵母膏购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司；恒温生化培养箱(宁波东南仪有限公司)、高温灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)、超净工作台(山东博客科学仪器有限公司)、L5紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)、高速冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 果蝇寿命测定 参考叶文斌等[16-17]的果蝇饲养方法，配制基本培养基.在基本培养基中添加红芪加工废弃物多糖形成质量浓度为100、200、300和400 mg/L的处理培养基，设基本培养基为对照组.本试验考察果蝇的平均寿命，收集未交配的雌雄果蝇进行隔离培养，参考叶文斌等[16-18]的方法，在分装好的质量浓度为100、200、300和400 mg/L的4种处理培养基的培养瓶中接入果蝇，每瓶各接入50只，每一相同质量浓度的培养基各接10瓶(5♀，5♂)，以基本培养基为对照(CK)组，每天观察统计记录死亡个体数，计算后代数量的雌雄性别比，然后对统计的数据进行分析整理，平均寿命用每组所有果蝇寿命之和除以果蝇总数来表示，最高寿命用每组最后4只果蝇生存时间的总和除以4来表示，比较其与前者死亡率的差异[16-18].

1.2.2 急性损伤下的果蝇存活时间测定 果蝇分组情况同方法1.2.1.用体积浓度为6%的葡萄糖溶液配制成摩尔浓度为20 mmol/L的百草枯溶液和用体积浓度为9%的H2O2溶液备用，将收集的果蝇(不分雌雄)分别隔离培养饥饿2 h后，接入培养管中，取配制的百草枯溶液和H2O2溶液2 mL滴在滤纸条上，然后放入果蝇培养管中观察果蝇死亡数目，每隔4 h统计1次，直到试验果蝇全部死亡，记录每组果蝇的平均存活时间、半数存活时间和最高存活时间，具体参考周意等[19]的方法.

1.2.3 果蝇抗氧化活性测定 本试验所使用的方法主要参考叶文斌等[16-18]的方法，取基本培养基和质量浓度为100、200、300以及400 mg/L的5种处理培养基中适应培养了15 d的果蝇，随机各取雌雄50只，移入到空试管中，用乙醚麻醉后称重，在4 ℃条件下研磨，将研磨后的匀浆高速冷冻离心机离心15 min后，取上清液使用试剂盒来测定红芪加工废弃物多糖对果蝇的体内SOD活力、CAT活力和丙二醛MDA的含量.

1.3 数据统计与分析

试验数据通过SPSS17.0软件来统计，试验结果用单因素方差来进行分析，P<0.05表示显著差异有统计学意义，P<0.01表示极显著差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 红芪加工废弃物多糖对果蝇寿命的影响

不同质量浓度红芪加工废弃物多糖对果蝇世代寿命的统计结果如图1所示.随着多糖质量浓度的升高，F1-F4代雌、雄果蝇的寿命均呈现升高的趋势.当多糖质量浓度为100 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇的寿命，与对照组相比成显著差异(P<0.05).多糖质量浓度在200～400 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇寿命，都与对照组相比存在极显著差异(P<0.01).在400 mg/L的红芪多糖处理下果蝇寿命能延长约28 d左右，红芪加工废弃物多糖对果蝇世代雌雄性别比结果如表1所示，当多糖的质量浓度在100～400 mg/L之间时，F1-F4代雌、雄果蝇数量的比值接近1∶1，总体变化不明显.所以结果表明红芪加工废弃物多糖对果蝇寿命的具有明显的延长作用.

图1 红芪加工废弃物多糖对果蝇世代寿命的影响Fig.1 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on generational life of fruit flies

表1 红芪加工废弃物多糖对果蝇世代性别比影响Tab.1 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on generation sex ratio of fruit flies

2.2 红芪加工废弃物多糖对急性损伤下果蝇存活时间的影响

不同质量浓度红芪加工废弃物多糖对急性损伤下果蝇存活时间的影响结果如图2和图3所示.在百草枯和过氧化氢处理下，饲喂多糖质量浓度在300～400 mg/L时F1-F4代果蝇存活时间与对照组相比存在显著提高(P<0.05).饲喂多糖质量浓度在400 mg/L时，百草枯和过氧化氢处理F1-F4代果蝇平均存活时间比对照增加了约6 h，半数存活时间比对照增加了约4 h，最长存活时间比对照增加了约5 h，与对照组相比存在极显著差异(P<0.01).结果表明红芪加工废弃物多糖对百草枯和过氧化氢处理急性损伤下果蝇存活时间具有明显的延长作用.

图2 红芪加工废弃物多糖对百草枯急性实验果蝇存活时间的影响Fig.2 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on the survival time in paraquat treatment of fruit flies

图3 红芪加工废弃物多糖对过氧化氢急性实验果蝇存活时间的影响Fig.3 Effect of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on the survival time in hydrogen peroxidetreatment of fruit flies

2.3 红芪加工废弃物多糖对果蝇超氧化物歧化酶活性的影响

不同质量浓度红芪加工废弃物多糖对雌、雄果蝇体内SOD活性的影响结果如图4所示.当多糖质量浓度为100 mg/L时，与其他浓度相比，F1-F4代雌、雄果蝇体内SOD活性都最低，与对照相比存在显著差异(P<0.05)；随着多糖浓度的升高，F1-F4代雌、雄果蝇体内SOD活性均呈现出升高的趋势，当多糖质量浓度升高到200 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇体内SOD活性逐渐升高，与对照相比SOD活性升高存在显著差异(P<0.05).当多糖质量浓度为300～400 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇体内SOD活性与对照相比存在极显著差异的升高(P<0.01).

图4 红芪加工废弃物多糖对果蝇超氧化物歧化酶活性的影响Fig.4 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on superoxide dismutase activity of fruit flies

2.4 红芪加工废弃物多糖对果蝇过氧化氢酶活性的影响

随着红芪加工废弃物多糖质量浓度的升高，多糖对雌、雄果蝇体内CAT活性的影响结果如图5所示，F1-F4代雌、雄果蝇体内的CAT活性均呈现出逐渐上升的趋势，当多糖质量浓度为100 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇体内CAT活性明显高于对照组，与对照组相比成显著性差异(P<0.05)，当多糖质量浓度为400 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇体内CAT活性对照相比升高成极显著差异(P<0.01).

图5 红芪加工废弃物多糖对果蝇过氧化氢酶活性的影响Fig.5 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on catalase activity of fruit flies

2.5 芪加工废弃物多糖对果蝇丙二醛含量的影响

不同质量浓度红芪加工废弃物多糖对雌、雄果蝇体内MDA含量的影响如图6所示.随着多糖浓度的升高，F1-F4代雌、雄果蝇体内MDA含量均呈现出先升高后降低的趋势.当多糖质量浓度为100 mg/L时，F1-F4代雌、雄果蝇体内的MDA含量低于对照组(P<0.01)；当多糖质量浓度为300～400 mg/L时，MDA含量与对照组相比低于对照组(P<0.01).这也说明，随着多糖质量浓度的升高红芪加工废弃物多糖对果蝇的清除MDA的能力逐渐提高，果蝇的抗氧化作用也逐渐增强.结果表明红芪加工废弃物多糖能显著提高F1-F4代雌、雄果蝇世代SOD和CAT活性和降低MDA含量，提高了果蝇的抗氧化能力和生命力.同时还发现，在不同多糖质量浓度处理下雄性果蝇体内SOD和CAT活性均比雌性果蝇高，雌性果蝇体内MDA含量低于雄性果蝇体内的含量，这也说明，雄性果蝇的抗氧化能力强于雄性果蝇.

图6 红芪加工废弃物多糖对果蝇丙二醛含量的影响Fig.6 Effects of polysaccharides extract from Hedysarum polybotrys processed waste on malondialdehyde contents of fruit flies

3 结果与讨论

红芪多糖主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成[20]，具有很好的抗氧化活性[21]和较强的氧自由基、超氧阴离子、羟自由基清除能力，对脑微血管内皮细胞氧化损伤具有很好的保护作用，在氧化低密度脂蛋白氧化损伤模型动物中具有明显的抑制细胞凋亡和抗氧化应急功能，显著提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性[22-24].但在哺乳动物模型的数量和试验成本的限制下，寿命实验在哺乳动物模型中研究较少，而黑腹果蝇作为试验动物进行寿命和急性损伤的评价研究，是因为具有遗传背景清楚、生存期短和繁殖量大的特点，而且饲养简便和反应灵敏，同时果蝇的代谢系统、生理功能和性别决定以及生长发育与哺乳动物基本相似[16-18]，故多应用于生育力、衰老或寿命、功能保健食品评价等方面的研究[16-19].在药物和功能食品研究中，果蝇常用作延缓衰老实验模型，特别是在遗传生物学和毒理学研究中应用较多[16-19].

本研究探讨了不同质量浓度的红芪加工废弃物多糖对黑腹果蝇寿命和急性损伤下果蝇存活时间，SOD和CAT两种抗氧化酶的活力的影响，同时考察MDA含量的变化.试验结果表明，红芪加工废弃物能显著提高F1-F4代雌、雄果蝇世代寿命，在质量浓度为400 mg/L的红芪多糖处理下能延长果蝇寿命约28 d，同时降低了果蝇体内MDA含量，升高了SOD和CAT的活性.延长了急性损伤下果蝇存活的时间，在质量浓度为400 mg/L的红芪多糖饲喂过的果蝇在过氧化氢和百草枯急性氧化损伤下平均存活时间延长了约6 h，半数存活时间增加了约4 h，最长存活时间增加了约5 h，果蝇的抗氧化能力和生命力也得到了提高，雌性果蝇的抗氧化作用强于雄性果蝇，F1-F4代雌、雄果蝇数量的比值接近1∶1，总体变化不明显.

果蝇的衰老与体内MDA含量、SOD和CAT两种抗氧化酶活力的水平密切相关[7-8]，积累过多的MDA会增加细胞膜的透性，破坏膜的完整性，导致其他大分子进入细胞结合到细胞器和核膜上与不饱和脂肪酸发生反应，影响DNA合成及蛋白质等生物大分子的结构[8-9]，从而导致衰老，甚至死亡[13].红芪多糖是一种具有多种生物活性功能的大分子物质，当用多糖饲喂果蝇后，果蝇体内SOD和CAT两种抗氧化酶的活力和细胞膜过氧化脂质的分解产物MDA含量都发生了较为明显的变化，这种结果已经表明红芪多糖与果蝇寿命和衰老之间存在一定的关系.MDA是脂质过氧化产生的的分解产物，是动物机体抗衰老评价的重要指标之一，它的含量变化与抗氧化酶系中SOD和CAT两种酶的活性密切相关，而红芪加工废弃物多糖能够降低MDA，显著升高SOD和CAT的抗氧化活性，这就提示多糖具有很好的清除自由基和减少脂质过氧化过程的作用，起到延缓衰老，延长寿命和提高生命力的功效.MDA含量急剧降低，SOD和CAT的抗氧化活性显著升高，这种现象可能是多糖分子参与机体复杂生物化学反应，刺激果蝇主动启动SOD和CAT清除体内产生的MDA等自由基，促使升高了两者的量，来主动增强果蝇的抗性，同时间接促进寿命.这将为开发无毒无副作用的抗氧化、抗衰老替代药物和功能食品提供依据，也为红芪加工废弃物的再利用和综合开发利用提供技术.