超高压处理对黑果枸杞汁贮藏及品质特性的影响

蒲 莹,高庆超,孙培利,王树林,2,*

(1.青海大学农牧学院,青海西宁 810016;2.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,青海西宁 810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)是我国西北荒漠地区独有的一种药食两用的多棘刺灌木植物,属茄科,主要分布在中国陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏;中亚、高加索和欧洲亦有分布。黑果枸杞耐干旱,生于盐碱荒地、沙地等[1]。黑果枸杞含有丰富营养活性物质,如蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等,有研究表明,黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血压、降血糖和保肝等药理活性,在食品、医药、卫生和化妆品等领域具有广泛的应用价值[2]。目前,对于黑果枸杞的加工多采用自然干燥直接食用、制作黑果枸杞软糖、枸杞压片[3]等产品。黑果枸杞汁具有黑果枸杞原有的色泽和口感,里面大量营养成分没有被破坏,在很大程度上满足了消费者对黑果枸杞保健功能的需求,黑果枸杞汁加工技术的改进是实现黑果枸杞产业化生产的重要保障。

已有研究证明加热处理作用于共价键,破坏了果蔬汁中的营养成分,导致不良风味的产生[4]。超高压技术(Ultra high pressure processing,UHP)是一种在食品行业中极具发展潜力的食品加工方法,能改变生物体高分子中的非共价键结构,使蛋白质变性、淀粉糊化、酶失活、微生物菌体破坏而死亡[5],从而延长食品保质期。超高压却不会改变共价键结构,因此能更好地保持食品的营养和感官特性。UHP是以水或其他液体介质为传递压力的媒介物,处理压力通常高于100 MPa[6]。常温或较低温度条件下,利用高压使食品中的酶、蛋白质及淀粉等生物大分子改变活性、变性或糊化[7]。

近年来,利用超高压技术加工果汁的研究也越来越多,如Juarez-Enriquez等[8]利用色泽、总多酚含量、抗氧化能力、抗坏血酸含量、pH、可滴定酸度、总可溶性固形物、多酚氧化酶(PPO)活性、果胶甲基酯酶(PME)活性及感官检测等评价了超高压处理金苹果汁。结果表明处理后的苹果汁理化性质、营养价值、感官属性均无显著变化(P>0.05)。Yu等[9]比较了超高压均质技术和传统的巴氏杀菌技术对桑葚汁中各成分的影响。结果表明经过超高压处理的果汁中,花青素、酚酸(没食子酸,原儿茶酸,咖啡酸和对香豆酸)和槲皮素糖苷配基含量以及氧化自由基吸收能力降低更多。Aaby等[10]研究了高压和热处理对草莓汁货架期和品质的影响,结果显示高压处理对于果汁中花色苷、维生素C含量和色泽和感官指标没有明显的影响,表明超高压加工方式在果蔬汁加工方面的优势。虽然超高压技术已经在果汁加工中广泛应用,但没有关于超高压处理黑果枸杞汁的贮藏及品质变化的研究。

本研究针对热处理黑果枸杞汁易使其营养成分被破坏,抗氧化活性物质花青素被降解等问题,采用超高压技术对黑果枸杞汁分别进行(300、400、500 MPa)处理10 min,并选用巴氏杀菌75 ℃水浴加热15 min和不做任何处理的样品作为对照,对其在贮藏期的品质变化进行动态跟踪研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑果枸杞 采于青海省诺木洪地区;氢氧化钠、盐酸、硫酸、没食子酸、氯化钾 分析纯,上海广诺化学科技有限公司;多酚氧化酶试剂盒、过氧化物酶试剂盒 南京建成生物工程研究所;孟加拉红培养基、菌落计数培养基、福林酚试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ) 北京索莱宝科技有限公司。

HHP600/5L型超高压处理设备 包头科发高压科技有限公司;ZD-LZ-0.5螺旋榨汁机 靖江市中德机械制造厂;UV-1780型分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑果枸杞汁制备工艺 将黑果枸杞摘除果柄、清洗后,进行榨汁,离心沉淀,取上清液备用[11]。将黑果枸杞汁分装于30 mL耐压塑料瓶中,用封口膜密封。

1.2.2 黑果枸杞汁处理与贮藏 试验处理分为超高压处理和热处理对照组。

超高压处理[12]:采用200、300、400、500 MPa压力下处理10 min。

巴氏杀菌组:黑果枸杞汁在恒温水浴锅75 ℃加热15 min。

空白对照组:将1.2.1得到的黑果枸杞汁不做任何处理,于贮藏条件下贮藏。

贮藏期条件:样品处理完成后,分别贮藏于4和37 ℃,避光,分别于第0、10、20、30、40 d取样对相关指标进行测定。

1.2.3 微生物测定 根据《GB 4789.2-2016》相关要求进行菌落总数,酵母菌、霉菌的计数。平板计数培养基和孟加拉红培养基配制方法参考尹琳琳等[13]方法,并稍作修改。

1.2.4 POD酶、PPO酶活性测定 PPO酶和POD酶活性的测定采用试剂盒法,在420 nm处测定吸光度,计算酶活性。

1.2.5 总酚含量测定 总酚含量测定采用福林酚法[14]。标准曲线用没食子酸标准品溶液绘制,标准曲线为Y=0.0112x+0.0333,R2=0.9979。

1.2.7 花青素含量测定 花青素含量的测定采用pH示差法[16]。

1.2.8 DPPH自由基清除率 参考丁艳如等[17]方法,取25 μL样品提取液,加入到4 mL DPPH溶液中,常温避光1 h,测定吸光值。以不加样品的DPPH溶液为对照,每100 g样品清除DPPH自由基的能力以清除同等DPPH自由基的维生素C的克数表示。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1为样品和DPPH的吸光度；A2为样品和甲醇溶液的吸光度;A0为甲醇和DPPH溶液的吸光度。

1.2.9 FRAP亚铁离子还原能力 参照Yu等[18]的方法。样品测定取100 μL样品提取液,加入到4 mL TPTZ工作液(该工作液由0.3 mol/L的醋酸缓冲液、10 mmol/L的TPTZ溶液和2 mmol/L的FeCl3按体积比10∶1∶1配制而成)中,37 ℃反应15 min后,测定其在593 nm处的吸光值。每100 g样品的FRAP值以还原同等铁离子的Trolox标准溶液的克数表示。Trolox标准溶液的浓度与吸光值的标准曲线为:Y=0.0039x+0.0011,R2=0.9987。

1.3 数据处理

所有试验均做3组平行,结果用平均值±标准差表示,利用Excel 2007、SPSS Statistics 20.0等统计软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期微生物的影响

由表1可知,超高压处理压力不小于300 MPa时菌落总数的对数值均能降低到1.0 lg cfu/mL以下,且在贮藏40 d期间菌落总数没有增加,这与朱香澔等发现的[19]在200～550 MPa能全部杀灭全部微生物的结果不同,可能是菌群或样品差异对微生物的抗压保护作用不同所造成的。同时巴氏杀菌也符合国家食品卫生不大于100 cfu/mL标准的要求,并在贮藏期间没有发生微生物增加的现象。空白对照在4 ℃条件下贮藏,微生物数量在贮藏期间没有明显变化,在37 ℃贮藏条件下,菌落总数在贮藏前30 d没有出现较大变化,在30 d后呈现减少趋势,这可能是由于适宜温度下微生物进行繁殖,果汁样品内的营养物质被消耗,微生物呈现出从正常生长期到衰亡期的正常变化规律。200 MPa以下的处理压力均不能有效杀灭微生物,这和徐夏旸等[20]研究的超高压对白胡萝卜汁的灭菌的结果一致,后续其它指标测定将不再考虑200 MPa以下的条件。此外,超高压和巴氏处理的黑果枸杞汁在贮藏期间均未检出酵母菌、霉菌。

表1 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间菌落总数的变化Table 1 Total numbers of colony changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

2.2 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期的POD酶和PPO酶活性的影响

由表2～表3可知,超高压处理压力大于300 MPa,能有效钝化POD酶,酶活性显著低于空白对照(P<0.05),且当压力大于400 MPa时,POD酶活性降低到了0.5 U/mL以下,这与马越等[21]研究超高压处理对番茄中POD酶活性影响一致。在贮藏期间,300 MPa处理的黑果枸杞汁中POD酶活性呈现下降趋势,400 MPa以上处理POD酶活性没有发生变化。巴氏杀菌处理也能有效钝化POD酶,其活性降低到了0.5 U/mL以下,且在贮藏期间没有发生变化。

表2 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间POD酶活性的变化Table 2 Activity of POD enzyme in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

表3 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间PPO酶活性的变化Table 3 Activity of PPO enzyme in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

当处理压力为300 MPa时,超高压处理不能有效钝化PPO酶的活性,与空白对照相比PPO酶活性略有增强,但是差异不显著,这可能和超高压处理导致PPO酶中的肽键受到压力作用逐渐形成α-螺旋结构,并且在分子中形成三重螺旋结构,从而缩短了氢键的长度,并增强了螺旋的紧密度,所以才会出现有小幅度铵的活性增强现象[22]。在贮藏期间,300 MPa处理的黑果枸杞汁中的PPO酶呈现下降趋势,400 MPa以上处理PPO酶活性没有发生变化。

2.3 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期间活性物质含量的影响

2.3.1 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期间总酚含量 由表4可知,未处理的黑果枸杞汁中的总酚含量为(87.17±0.03) mg/100 g,不同压力的超高压处理对黑果枸杞汁中的总酚含量没有影响,分别为(87.10±0.13)、(87.11±0.03)、(86.92±0.01) mg/100 g,和空白对照之间没有显著性差异(P>0.05)。在不同的贮藏条件下,随着贮藏时间的增加,总酚含量在逐渐减少。直至贮藏结束,在4和37 ℃贮藏条件下,采用500 MPa处理超高压处理的黑果枸杞汁总酚含量组减少最多,分别减少了22.87和24.41 mg/100 g,4 ℃条件下贮藏的黑果枸杞汁总酚含量在均大于37 ℃条件下贮藏的果汁。

表4 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间总酚含量的变化(mg/100 g)Table 4 Total phenolic content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/100 g)

与空白对照相比,巴氏杀菌处理组总酚含量减少了14.59 mg/100 g,并且在4和37 ℃贮藏期间分别减少了27.54和31.13 mg/100 g,减少量大于超高压处理组。许文文等[23]研究超高压对草莓果肉饮料贮藏品质的变化发现在贮藏期间草莓果肉饮料中的总酚一直在减少,到贮藏结束下降了34.14%。总酚含量减少可能是残存的少量多酚氧化酶作用,同时在贮藏过程中儿茶素等酚类物质发生氧化也会导致酚类物质减少,酚类物质减少还和果汁种类、溶解氧、酶等多种因素有关。

2.3.2 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期总多糖含量的影响 由表5可知,未处理的黑果枸杞汁中的总多糖含量为(61.86±0.71) mg/mL,超高压处理的不同压力对黑果枸杞汁中的总多糖含量没有影响,分别为(61.54±0.19)、(61.04±0.17)、(60.97±0.25) mg/mL,和空白对照之间没有差异(P>0.05)。在不同的贮藏条件下,随着贮藏时间的增加,总多糖含量在逐渐减少。直至贮藏结束,在4和37 ℃贮藏条件下超高压处理总酚含量400 MPa处理组减少最多,分别减少了3.16和8.47 mg/mL,所有处理组总多糖含量在4 ℃贮藏条件下均大于37 ℃条件下贮藏。

表5 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间总多糖含量的变化(mg/mL)Table 5 Total polysaccharide content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/mL)

巴氏杀菌处理明显减少了总多糖含量,与空白对照相比,减少了4.62 mg/mL,并且在4和37 ℃贮藏期间分别减少了7.07和10.29 mg/mL,减少量大于超高压处理组。与超高压处理比较,巴氏杀菌明显减少总多糖含量(P<0.05),这可能是由于高温使黑果枸杞汁中的还原糖发生美拉德反应造成的,总多糖变化趋势与总酚变化趋势相似,在20 d左右下降速度增大。高歌[24]研究的超高压对红柚汁品质影响发现经超高压处理后的红柚汁蔗糖和果糖含量显著下降,葡萄糖含量未发生显著性变化,与本研究结果一致。总多糖含量的降低可能与蔗糖转化酶等多种酶的作用有关。

2.3.3 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期花青素含量的影响 由表6可知,未处理的黑果枸杞汁中的花青素含量为(2.68±0.08) mg/mL,超高压处理的不同压力对黑果枸杞汁中的花青素含量没有影响,分别为(2.62±0.05)、(2.56±0.01)、(2.58±0.09) mg/mL,和空白对照之间没有显著性差异(P>0.05)。在不同的贮藏温度下,随着贮藏时间的增加,处理的和未经处理的黑果枸杞汁中的花青素含量在贮藏期间都在缓慢减少,超高压处理组除了(500 MPa/10 min)外,其余组花青素减少量和空白对照相比差异不明显,从贮藏30 d开始,在37 ℃条件下贮藏的500 MPa超高压处理组的花青素含量与空白对照相比出现了显著性差异(P<0.05),贮藏结束时,花青素含量减少高于其它超高压处理组,约为1.21 mg/mL。

表6 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间花青素含量的变化(mg/mL)Table 6 Total anthocyanin content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/mL)

巴氏杀菌降低了花青素含量,与未做任何处理的空白对照相比,巴氏杀菌导致花青素含量减少了0.72 mg/mL,在4 ℃和37 ℃贮藏条件下,直至贮藏结束,分别减少了0.75和0.94 mg/mL,减少量大于超高压处理组。37 ℃贮藏条件下花青素的损失比4 ℃贮藏损失高,这与花青素结构极不稳定,容易在加热条件下发生降解有关。

2.4 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期间抗氧化能力的影响

2.4.1 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期间DPPH自由基清除率的影响 由表7可知,未处理的黑果枸杞汁对DPPH自由基清除率为88.88%±0.88%,超高压处理(300、400、500 MPa)对黑果枸杞汁对DPPH自由基清除率分别为86.82%±0.76%、87.40%±0.39%、86.60%±0.38%,和空白对照之间没有差异(P>0.05),且400 MPa处理对自由基清除率略高于其它处理组。在不同的贮藏温度下,随着贮藏时间的增加,样品对DPPH自由基清除能力在逐渐降低。超高压处理组在4 ℃条件下开始贮藏直至结束DPPH自由基清除率分别下降了16.90%、17.36%、16.36%,37 ℃条件下贮藏期间下降约19.52%、19.61%、19.70%。从第30 d开始,在37 ℃条件下贮藏的500 MPa超高压处理组对DPPH自由基清除率与空白对照出现了明显差异,贮藏结束时,其对DPPH自由基清除能力降低最多,为19.70%。

表7 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间DPPH自由基清除能力的变化(%)Table 7 DPPH radical scavenging rate in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(%)

巴氏杀菌处理对DPPH自由基清除率影响较大,与空白对照相比,下降了6.71%,4 ℃贮藏期间下降了19.89%,而37 ℃贮藏期间下降了25.32%。

2.4.2 超高压处理对黑果枸杞汁贮藏期间亚铁离子还原能力的影响 由表8可知,未处理的黑果枸杞汁中的亚铁离子还原能力为15.81±0.14 μg/100 mL DW,超高压处理对黑果枸杞汁中亚铁离子还原能力没有影响,分别为15.74±0.04、16.15±0.41、15.95±0.25 μg/100 mL DW,和空白对照之间没有显著差异(P>0.05),且400和500 MPa处理对亚铁离子还原能力略高于其它处理组。在不同的贮藏条件下,随着贮藏时间的增加,其对亚铁离子的还原能力在逐渐降低。超高压处理组在4 ℃贮藏期间对亚铁离子还原能力下降分别为1.08、1.44、1.33 μg/100 mL DW,37 ℃贮藏期间下降分别为3.24、3.58、3.49 μg/100 mL DW。在整个贮藏期间,不同贮藏条件下的超高压处理组与空白对照相比,均没有出现显著性差异。

表8 处理前后黑果枸杞汁贮藏期间亚铁离子还原能力的变化(μg/100 mL DW)Table 8 Ferrous ion reduction ability in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(μg/100 mL DW)

巴氏杀菌处理对亚铁离子还原能力影响较大,与空白对照相比,减少了2.11 ug/100 mL DW。4 ℃贮藏期间下降1.6 μg/100 mL DW,而37 ℃贮藏期间下降3.57 μg/100 mL DW。

3 讨论

超高压处理条件对黑果枸杞汁中的酵母、霉菌及菌落总数的杀灭效果不同200 MPa压力条件下可完全杀灭酵母和霉菌,300、400和500 MPa能使黑果枸杞汁符合国家卫生标准,并且在贮藏期间不会有微生物生长现象发生。超高压对微生物的灭活效果随微生物种类不同而不同,在相对较低的压力条件下就可以杀灭寄生虫等生理结构相对复杂生物,压力大于200 MPa就可以完全杀灭酵母菌、霉菌,由于细菌种属繁多,不同种属菌种耐压能力不同,总体而言,革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更耐高压,主要是因为革兰氏阳性菌肽聚糖层的磷壁酸更厚[25]。

果汁中的多酚氧化(PPO)酶和过氧化物(POD)酶是影响果汁品质的重要酶,多酚氧化酶是导致酶促褐变发生的主要酶,其活性的多少直接影响果汁的色泽等品质。过氧化物酶在果蔬体内参与 ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)转变成乙烯的作用,并且在酚类物质存在下能降解叶绿素和参与吲哚乙酸的氧化[26]。超高压处理黑果枸杞汁在300 MPa以上能有效钝化POD酶,其活性降为未处理的1/2,在300 MPa以上能使POD酶活性降低到0.5 U/mL以下。PPO酶相较POD酶有较强的耐压性,300 MPa未能显著降低其活性,400 MPa以上压力能钝化其活性,使其降低到0.5 U/mL以下。因为酶是蛋白质结构,多肽链形成的α-螺旋、β-转角、β-折叠及无规卷曲等结构[22],它靠多肽链内或肽链间的氢键稳定其结构,所以超高压处理对于蛋白的二级结构影响是未知的,这与果汁种类以及酶的特殊蛋白结构有关。

花青素的基本结构为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃,其极不稳定,通常以糖苷化和酰基化的形式存在,易受pH、光照、温度、金属离子、酶等因素影响发生降解[27]。不同的花青素结构会导致其结构的稳定性有很大的差异,花青素B环取代基会影响其稳定性,杭园园等[28]研究发现黑果枸杞的花青素类型主要是矮牵牛素,B环取代基主要是羟基和甲氧基,使得黑果枸杞中花青素较自然界中其它甲基化和酰基化的花青素[29]更为不稳定。花青素含量在超高压500 MPa/10 min处理条件下有所下降,发现样品在处理过程中,压力每升高100 MPa,超高压设备内部温度会增加5 ℃左右,超高压处理对花青素含量的影响与处理过程中温度的升高有一定关系。此外,37 ℃条件下贮藏的黑果枸杞汁中花青素含量显著降低,这和它的贮藏温度有极大的关系,Jarkko等[30]研究发现在研究不同果汁花青素在不同温度下贮藏稳定性时发现,随着温度的增加花青素降解半衰期迅速缩减,4和21 ℃的贮藏条件下花青素的半衰期分别是32.5周和6.73周。由此推测37 ℃的贮藏温度导致花青素半衰期更短。Tiwari等[31]研究发现花青素的减少除了本身性质外,还与多酚氧化酶、过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性有关,酶活性越低,花青素损失越少,贮藏期花青素含量的减少可能和高压处理后未完全钝化这几种酶有关。

超高压处理不会作用于小分子物质,有时高压处理会使部分活性物质含量升高,郑欣等[32]对香蕉汁进行500 MPa处理2 min后发现在贮藏8周后总酚含量略微增加,Spanos等[33]发现葡萄汁在25 ℃贮藏9个月期间总酚含量增加是因为聚合多肽酚降解,导致总酚含量增加。

超高压处理后的黑果枸杞汁未表现出明显的抗氧化能力降低的情况,于勇等[34]发现用超高压处理糙米,在100～300 MPa范围内,抗氧化能力随着压力的增大而增大。白洁等[35]研究发现对黑莓汁进行300 MPa超高压处理15 min,有机酸含量减少,抗氧化能力降低,400、500、600 MPa处理15 min,随着压力的增高,其中苹果酸含量增加抗氧化能力也随之增强。

4 结论

超高压处理压力增大,微生物存活量急剧下降,300 MPa以上压力处理10 min均能使黑果枸杞汁达到国家卫生标准,且在贮藏过程中没有发生微生物增殖现象;高压处理400 MPa能有效钝化PPO酶和POD酶,减缓了黑果枸杞汁褐变和氧化速率;与巴氏杀菌比较,超高压处理在极大程度上保证了活性物质的保留率和抗氧化能力。综合杀菌、钝酶效果和能耗关系,生产中对黑果枸杞汁处理压力控制在400 MPa,时间控制10 min为宜。综上,超高压对于黑果枸杞汁的处理在有效灭菌钝酶的同时,在活性物质和抗氧化能力保持方面更是优于常规热杀菌。低温贮藏与超高压技术结合将更有利于黑果枸杞汁进一步加工利用和实现产业化发展。