合欢皮正丁醇提取物的毒理学评价＊

侯 豹，李忠杰，孙姜楠，艾 敏，蔡维维，倪露露，邱丽颖

研究表明，焦虑的特征是具有持续的恐惧感，不仅阻碍人体机能的放松，还会加速衰老［1-3］。对焦虑的深入研究有助于临床药物的开发和身心健康的全面发展［4］。合欢皮作为一种民间药物，对失眠、乏力、意识不清有良好的治疗作用［5］。合欢皮水提物的化学成分包括皂甙、木脂素、酚苷、黄酮和生物碱［6］，其中主要成分为皂甙和木脂素［7］。 然而，合欢皮正丁醇提取物作为一种中药混合物，当前对其毒性反应的研究尚不清楚。肝脏作为一个主要的代谢和解毒器官，参与许多重要的生理功能［8］。药物和天然产物都可以通过各种机制引起肝损伤、肾损伤等［9］。笔者研究合欢皮正丁醇提取物的肝毒性和肾毒性，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂AST、ALT、AKP、TP、白蛋白、CRE、BUN和尿蛋白试剂盒均取自南京建诚生物科技有限公司，苏木精和伊红购自武汉博士得生物工程技术有限公司，合欢皮正丁醇提取物购自上海合武生物科技有限公司。沃特斯1525高效液相色谱仪，紫外可见检测器（2489型）。

1.2动物该研究经江南大学伦理委员会批准。所有小鼠均取自上海斯莱克实验动物有限公司。所有小鼠均在隔离设施中，在恒定的温度和湿度控制的环境中喂养，进行12 h昼夜光照循环。用15只8周龄、体重20～25 g的雌性小鼠（ICR）研究了ANE的体内毒性。三组分别给予PBS、ANE （8 mg/kg）和ANE（40 mg/kg），每日 0.2 ml胃肠道给药，连续给药30 d，取尿、内脏和血液进行分析。用15只6周龄、体重18～20 g的雌性小鼠（C57BL/6）研究ANE对肿瘤生长的影响。选择的剂量是根据人类最高治疗剂量（45 mg/70 kg·d，主要抑郁症推荐的最大治疗剂量）的1倍和5倍作为动物的给药剂量。从人到动物的剂量转换是根据体表面积换算公式进行［10］。使用了以下公式［11］：Animal dose（mg/kg）=［Human Dose（mg/kg）×Human Km］/Animal Km，其中，Km 是一个相关系数，通过将动物的平均体重（kg）除以其表面积（m2）计算得出：人类 Km=37，小鼠 Km=3。

1.3血液分析先从小鼠眼球采集血液进行分析。动物处死后，迅速取出心、肝、脾、肺、肾等组织进行病理学检查。血液样本孵育1 h，离心后取上清（2000 r/m，5 min）。采用ELISA试剂盒（南京建成生物科技有限公司）检测血清。

1.4植物提取与鉴定采用75%EtOH提取合欢皮粉，然后将合欢皮粉过滤，减压浓缩于旋转蒸发器中。将提取液悬浮于水中，分别用乙醇酸乙酯和正丁醇对其进行分离，用高效液相色谱法对合欢提取液进行了表征，并在 C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）上对其进行组分分离。流动相采用0.1%甲酸-水（A-乙醇（B）梯度洗脱，紫外检测波长254 nm。

1.5苏木精伊红染色法心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和肿瘤用4%多聚甲醛缓冲液固定，按常规组织处理方法进行处理，处理后组织石蜡包埋。制备5 μm厚的皮肤组织切片，然后按标准方法用苏木精和伊红（H＆E）染色，并在光学显微镜（Nikon ECLIPSE 80i）下进行观察。

1.6统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量数据以（）表示。采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ANE成分鉴定研究表明，该ANE的主要成分为皂甙和木脂素，其指纹图谱如图1所示。

2.2 ANE对肝脏的毒性反应ANE对肝脏的毒性反应。如图2a所示为8 mg/kg和40 mg/kg组的肝脏指数，与对照组相比，40 mg/kg组血清中AST和白蛋白的活性水平显著降低（图2b和f）。8 mg/kg组和40 mg/kg组的ALT、AKP和TP（总蛋白）活性没有显著差异（图2c～e）。由图2g可见，H＆E染色结果显示：40 mg/kg组血窦扩张，门静脉周围可见散在变性空泡细胞，8 mg/kg组小叶结构正常。

2.3 ANE对肾脏的毒性反应ANE对肾脏的毒性反应。如图3a所示，8 mg/kg、40 mg/kg组与对照组肾脏指数无差异。与对照组相比，40 mg/kg组血清BUN和尿蛋白活性水平显著降低（图3c和d）。如图（3b和e）所示，CRE浓度和尿pH值变化不明显（P＞0.05）。H＆E 染色结果显示，8 mg/kg组肾皮质正常，可见肾小体、近曲小管和远曲小管。40 mg/kg组出现明显的肾小球充血和间质性出血（图3f）。

2.4 ANE对其他器官的毒性反应进一步探讨ANE对其他主要器官系统的潜在毒性反应。观察心、脾、肺毒性反应。8 mg/kg组和40 mg/kg组的心、脾和肺指数与对照组相比无显著性差异（图4a～c）。HE染色脾、心、肺等脏器的病理变化见（图4d～f）。结果分析表明，8 mg/kg给药组与对照组相比无明显变化。结果表明，8 mg/kg剂量的ANE对小鼠脾、心、肺均无毒性反应。同时评价了ANE对小鼠体重的影响。

图1 ANE的HPLC图谱

2.5 ANE对小鼠体重的影响给药初期，小鼠体重略有下降。给药中期，小鼠体重增加，给药结束时，小鼠体重逐渐增加（图5）。结果表明，灌胃给药后小鼠体重逐渐增加。ANE对小鼠体重无明显影响。

图2 ANE对肝的毒性作用

图3 ANE对肾脏的毒性作用

图4 ANE对其他器官的毒性作用

图5 ANE对小鼠体重的影响

3 讨论

中药合欢皮具有良好的抗焦虑作用，其有效成分主要集中在ANE中。已有报道ANE对癌症患者具有抗焦虑作用，但是对ANE的毒性反应还没有深入的研究。

肝肾功能是评价药物毒性反应的重要指标之一［12］。因为肝脏既是毒性的主要靶点，又是主要的代谢和解毒器官。药物、外源性物质、天然产物和工业毒物都可以通过多种机制造成肝损伤。血清中某些酶的活性，通常被称为肝酶。这些酶包括天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（AKP）［13］。它们广泛应用于从筛选肝病到监测药物不良反应，以及确定对特定肝病的治疗反应［14］。白蛋白主要在肝脏合成，但白蛋白mRNA也可在胰腺、肾脏和大脑中检测到［15］。白蛋白是肝硬化最重要和最广泛使用的预后指标［16］。40 mg/kg组血清AST和白蛋白水平降低可能是肝功能不全所致（图3b 和 f）。

与其他组织相比，肾脏可能暴露在更高浓度的毒物中。肾损伤可导致广泛的系统性紊乱，由于再生能力有限，长期肾功能不全可能是由于接触肾毒性物质所致。最常用的肾功能评估指标是血尿素氮（BUN）和血清肌酐（CRE）浓度。血尿素氮的变化是肾损害的重要指标［17］。尿蛋白是心血管和肾脏损害的有力预测因子，准确评估尿蛋白对评估和管理慢性肾脏疾病至关重要［18］。40 mg/kg组BUN和尿蛋白活性降低可能是由肾功能衰竭、肾炎和其他因素引起的（图 4c和 d）。

该研究主要探讨合欢皮正丁醇提取物的毒性。与对照组比较，8 mg/kg组无显著毒性反应，肝和肾功能指标无异常。但随着ANE剂量增加到40 mg/kg，肝肾等内脏器官开始受到毒性反应影响。