黄芪总皂苷对心衰大鼠心肌细胞凋亡和线粒体膜电位的影响

尤 旭，朱小芳，胡运鹏，龚 杨，赵 磊

(荆州市中心医院 院前急救科,湖北 荆州 434000)

心力衰竭(heart failure)是诱发心脏病患者死亡的重要原因，其中心肌组织损伤是心力衰竭发生的重要机制[1]。黄芪具有补中益气、利水清肿等功效，黄芪总皂苷(total astragalosides，ASTs)是黄芪的主要活性成分，具有抗肿瘤、增强免疫力、改善组织纤维化等作用[2-3]。黄芪总皂苷对于心血管系统疾病也具有明显的改善作用，其可以减少氧化应激诱导的心肌细胞凋亡，改善异丙肾上腺素诱导的心肌损伤，并且对于心室重构大鼠具有明显的保护作用[4-6]。现阶段对于黄芪总皂苷在心衰大鼠心肌细胞凋亡中的作用及机制还不清楚。本实验以黄芪总皂苷灌胃处理心衰大鼠模型，探讨黄芪总皂苷对心肌细胞凋亡的作用和机制，为黄芪总皂苷治疗心衰的临床应用及机制提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(220±10)g；(武汉大学动物实验中心，合格证号Y20160912)；SOD活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；p-AKT抗体、c-caspase-3抗体、p-p38MAPK抗体(Abcam公司)；MDA含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；c-caspase-9抗体、cyt-c抗体(上海时代生物科技有限公司)；GSH-PX活性检测试剂盒(上海纪宁实业有限公司)；黄芪总皂苷(total astragalosides,ASTs)(上海纯优生物科技有限公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：大鼠在适应性饲养7 d以后随机分成5组，对照组(normal)、心衰组(model)、AST低(AST-L)、中(AST-M)、高剂量(AST-H)干预组，每组12只。AST低、中、高剂量干预组每天给予10、20、40 mg/kg的黄芪总皂苷灌胃，灌胃容量为10 mL/kg，对照组、心衰组每天给予等量的纯净水灌胃，连续灌胃5 d，在第6天时给予心衰组、AST低、中、高剂量干预组大鼠一次性腹腔注射10 mg/kg的盐酸阿霉素。

1.2.2 心功能的检测:在注射盐酸阿霉素后24 h，按照5 mL/kg用20%的乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，常规方法检测心功能。在心功能检测完之后，立即取各组大鼠的心肌组织，用于后续实验检测。

1.2.3 细胞凋亡观察：取大鼠心肌组织，用常规TUNEL法检测细胞凋亡，细胞凋亡率=(凋亡细胞数目÷细胞总数)×100%

1.2.4 SOD、GSH-PX和MDA含量的检测：取大鼠心肌组织，分别按照SOD(黄嘌呤氧化酶法)、GSH-PX(二硫代二硝基甲基苯)活性检测试剂盒和MDA(硫代巴比妥酸法)含量检测试剂盒检测SOD、GSH-PX活性以及MDA含量，步骤完全按照试剂盒操作说明进行，结果以红绿荧光比值表示。

1.2.5 JC-1法检测线粒体膜电位：取大鼠心肌组织，用JC-1法检测线粒体膜电位，步骤同试剂盒操作流程。

1.2.6 Western blot检测心肌c-caspase-3、c-cas-pase-9、p-AKT、p-p38MAPK蛋白和线粒体、胞质中cyt-c蛋白表达：取大鼠心肌组织，用Western blot检测蛋白表达。使用含有苯甲基磺酞氟(PMSF)的RIPA裂解试剂提取组织中的总蛋白，用于c-caspase-3、c-caspase-9、p-AKT、p-p38MAPK蛋白表达检测。使用线粒体或胞质蛋白提取试剂盒提取线粒体或胞质蛋白，用于cyt-c蛋白表达检测。Western blot步骤如下：用BCA方法检测提取的蛋白样品的浓度(步骤参照试剂盒说明书)，配制SDS-PAGE凝胶(10%的下层胶和5%的上层胶)，每个孔蛋白上样量为40 μg，蛋白在上样之前首先同等体积的2×上样缓冲液混合并煮沸5 min。蛋白电泳电压为100 V，等到染料进入到玻璃板的底部以后，将电源关闭，取出凝胶。转膜操作在冰上进行，转膜电压设置为80 V，转膜时间60 min。取出电转移后的NC膜，放在封闭液(5%牛血清白蛋白溶液)中，于室温条件下孵育2 h。然后将NC膜放在已经稀释好的一抗孵育液中，置于4 ℃条件下反应过夜。最后把NC膜放在1∶4 000稀释好的二抗孵育液中，放在室温中结合2 h。采用ECL显色试剂盒显色，Image J分析条带的吸光度值，计算蛋白表达变化。c-caspase-3、c-caspase-9、p-AKT、p-p38MAPK蛋白内参为GAPDH，线粒体、胞质中cyt-c蛋白内参分别为VCDA1和GAPDH。c-caspase-3、c-caspase-9、p-AKT、p-p38MAPK一抗分别按照1∶400、1∶400、1∶600、1∶600稀释，cyt-c抗体以1∶800稀释。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪总皂苷改善心衰大鼠心功能

黄芪总皂苷干预组大鼠LVSP(左室收缩内压)升高，+dp/dtmax和-dp/dtmax(左室内压最大变化速率)升高，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax随着黄芪总皂苷浓度的增加而增加(表1)。

表1 黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心功能指标Table 1 Cardiac function indexes of heart failure rats treated with total

2.2 黄芪总皂苷抑制心衰大鼠心肌细胞凋亡

心衰大鼠模型心肌细胞凋亡率升高，c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表达增多；黄芪总皂苷处理后的心衰大鼠心肌细胞凋亡率降低，c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表达水平也降低，并且随着黄芪总皂苷浓度的增加，抗细胞凋亡效果越好(图1,表2)。

图1 Western blot检测黄芪总皂苷对心衰大鼠心肌组织中c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表达影响Fig 1 Western blot to detect the effects of total astragal-osides on the expression of c-caspase-3 and c-caspase-9 in myocardium of rats with heart failure

2.3 黄芪总皂苷减轻心衰大鼠心肌组织氧化损伤

心衰大鼠模型心肌组织中抗氧化酶SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高；黄芪总皂苷处理后的心衰大鼠心肌组织中抗氧化酶SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量降低，并且随着黄芪总皂苷浓度的增加作用效果越强(表3)。

表2 黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心肌细胞凋亡率和c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表达水平影响Table 2 Effects of total astragalosides on cardiomyocyte apoptosis rate and c-caspase-3 and c-caspase-9 protein expression in rats with heart failure

表3 黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心肌组织中SOD、GSH-PX和MDA含量Table 3 Contents of SOD,GSH-PX and MDA in my- ocardium of heart failure rats treated with

2.4 黄芪总皂苷提高心衰大鼠心肌细胞线粒体膜电位并减少线粒体释放cyt-c

心衰大鼠模型心肌细胞线粒体膜电位降低，线粒体中cyt-c蛋白水平降低，胞质中cyt-c蛋白水平升高；黄芪总皂苷处理后的心衰大鼠心肌细胞线粒体膜电位升高，线粒体中cyt-c蛋白水平升高，胞质中cyt-c蛋白水平降低，并且随着黄芪总皂苷浓度的增加作用效果越强。黄芪总皂苷提高心衰大鼠心肌细胞线粒体膜电位，抑制线粒体释放cyt-c(图2，表4)。

2.5 黄芪总皂苷对心衰大鼠心肌组织中AKT、p38MAPK信号通路影响

心衰大鼠模型心肌组织中p-AKT/AKT水平降低，p-p38MAPK/p38MAPK水平升高；黄芪总皂苷处理后的心衰大鼠心肌组织中p-AKT/AKT水平升高，p-p38MAPK/p38MAPK水平降低，并且随着黄芪总皂苷浓度的增加作用效果越强。黄芪总皂苷促进心衰大鼠心肌组织中AKT信号激活并抑制p38MAPK信号激活(图3，表5)。

A.cyt-c protein expression in cytoplasm of cardiac myocytes;B.cyt-c protein expression in mitochondria of cardiac myocytes图2 Western blot检测黄芪总皂苷对心衰大鼠心肌细胞线粒体和胞质中cyt-c蛋白表达影响Fig 2 Western blot detection of the effect of total astragalosides on the expression of cyt-c protein in mitochondria and cytoplasm of cardiac myocytes in rats with heart failure

表4 黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心肌细胞线粒体膜电位以及线粒体、胞质中cyt-c蛋白水平

3 讨论

本实验结果发现，黄芪总皂苷灌胃治疗后的心衰大鼠模型心功能明显改善，并且心肌组织中细胞凋亡明显减少。研究报道表明，黄芪总皂苷对于心脑血管系统疾病也具有保护作用，其对于大鼠心肌缺血、心肌梗死等具有明显的改善作用，并且可以抑制病理条件下的心肌细胞凋亡[7-8]。本研究发现，黄芪总皂苷可以明显减少心衰大鼠模型心肌细胞凋亡，改善心功能，提示黄芪总皂苷能够改善心衰，这为黄芪总皂苷治疗心衰的临床应用提供了参考。

图3 Western blot检测黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心肌组织中p-AKT、p-p38MAPK蛋白表达Fig 3 Western blot detection of p-AKT and p-p38MAPK protein expression in myocardium of rats with heart failure after total astragalosides treatment

表5 黄芪总皂苷处理后心衰大鼠心肌组织中p-AKT、p-p38MAPK蛋白水平

心肌细胞过度凋亡是心衰发生的重要原因，而心肌细胞过度凋亡与氧化应激有关[9]。氧化应激条件下，氧自由基过度积累，而过量的氧自由基刺激线粒体，导致线粒体膜电位下降，使存在于线粒体中的cyt-c进入到细胞外，而胞质中的cyt-c可以激活caspase-9,caspase-9是caspase凋亡反应的起始因子，位于凋亡反应的上游，其活化后可以诱导下游凋亡执行因子caspase-3的活化，从而诱导细胞凋亡发生[10]。另外，细胞内过量的氧自由基可以将细胞内的脂质过氧化，产生MDA，细胞内过量的氧自由基聚集与细胞内抗氧化酶的活性降低有关，SOD、GSH-PX是广泛存在于细胞内的抗氧化酶，其活性的高低与细胞内氧自由基的聚集有直接关系[11]。本实验表明，黄芪总皂苷灌胃处理后的心衰大鼠心肌细胞中SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量降低，细胞中c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表达减少，线粒体膜电位升高，线粒体cyt-c蛋白增多，胞质cyt-c蛋白减少，提示黄芪总皂苷可能通过抑制氧化应激诱导线粒体凋亡途径而减少心肌细胞凋亡，这为研究黄芪总皂苷抗心衰作用机制提供了参考。

黄芪总皂苷发挥药理学作用与影响细胞内信号传导有关，其可以通过降低p38MAPK信号通路的激活程度而改善氧化应激诱导的细胞凋亡，黄芪总皂苷还能够通过激活AKT信号通路而抑制缺血诱导的神经损伤[12-13]。p38MAPK和AKT信号通路均与心衰有关，p38MAPK在心衰发生时过度激活，p-p38MAPK水平升高；激活AKT可以缓解心衰进展，减少心肌细胞凋亡发生[14-15]。本次实验表明，黄芪总皂苷降低心衰大鼠模型心肌组织中p38MAPK信号激活程度，提高AKT信号激活水平，提示黄芪总皂苷可能通过p38MAPK和AKT信号通路抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡发生。

总之，黄芪总皂苷具有改善心衰大鼠模型心功能的作用，其可以抑制心肌细胞凋亡，作用机制可能与调控p38MAPK和AKT信号通路减少氧化应激有关。这为研究黄芪总皂苷抗心衰作用机制提供了参考，为黄芪总皂苷治疗心衰的临床应用提供了理论依据。目前对于黄芪总皂苷的具体调控机制还不明确，在今后的实验中会进行验证和探讨。