一例罕见的分泌醛固酮的肾上腺皮质癌的全外显子测序

王慧萍，常晓燕，马晓森，童安莉*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.内分泌科 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室；3.病理科,北京 100730；2.河北北方学院 研究生学院,河北 张家口 075000)

原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，简称原醛症)是最常见的继发性高血压，约占高血压的5%[1]，原醛症常见的病因为醛固酮瘤和特发性醛固酮增多症，其他少见的病因有原发性肾上腺皮质增生、家族性醛固酮增多症、分泌醛固酮的肾上腺皮质癌和异位醛固酮分泌瘤或癌。分泌醛固酮的肾上腺皮质癌[aldosterone-producing (adrenocortical carcinomas,ACCs)]非常罕见，占原醛症病因的<1%[1-2]。而ACCs可分为功能性和无功能性，功能性中最常见为分泌皮质醇，其次为性激素，分泌醛固酮很少见，在ACCs中仅占2.5%[3-4]。由于分泌醛固酮的ACCs罕见，相关临床及基础研究极少。其肿瘤发生机制及醛固酮合成机制尚不清楚，本研究拟对一例分泌醛固酮的ACC进行全外显子测序，筛选与分泌醛固酮的ACC相关的突变基因。

1 材料与方法

1.1 研究对象

一例在北京协和医院诊治的分泌醛固酮的ACC患者。收集患者的临床资料，并留取外周血。本研究已获北京协和医院伦理委员会的审查批准(伦理审批编号：S-K1072)和受试者的知情同意。

1.2 组织全外显子测序

取患者的外周血和肿瘤的石蜡组织，用DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek)提取血和组织的DNA，送明码生物科技有限公司进行建库及全外显子测序，用安捷伦SureSelect Human all Exon V5试剂盒富集外显子，采用Illumina PE 150平台测序，测序深度>200×,Q30≥80%。用成对样本(肿瘤-外周血)过滤筛选组织中体细胞单核苷酸位点变异(single nucleotide variants，SNV)、插入和缺失(insertion-deletion，InDel)。

数据过滤：1)筛选千人<1%(MAF<0.01)；2)保留位于外显子区和剪切区；3)去掉同义突变(synonymous SNV)；4)软件预测致病性：至少2个以上软件预测为有害；5)参照MSK-IMPACT-468gene panel过滤与肿瘤发生有关基因。

在网站https://www.mycancergenome.org/上检索靶向治疗药物。

2 结果

2.1 患者病史

患者男性，55岁，2014年7月发现血压持续性升高，最高170/100 mmHg，无头晕、头痛，无心慌、心悸，无乏力、软瘫等；到当地医院就诊，生化及激素检测结果不详，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)示左肾上腺大小约5 cm占位(图1A)。行手术切除占位，病理：左肾上腺皮质腺瘤，部分区域生长活跃，免疫组化染色：Ki-67 10%，CgA(-)，术后患者血压正常。2017年11月患者发现血压再次升高，最高200/120 mmHg，伴头晕，无头痛、乏力、软瘫等，在当地医院查生化及激素结果不详，CT示左肾上腺区及左腹膜后多发3～4 cm占位(图1B)，手术中发现左肾上腺区、左腹膜后、左肾上、下极、左肾门和左腰大肌表面多发结节样肿块，切除左肾上腺区和左肾上极占位病变。病理：肾上腺皮质癌，核分裂增多并可见病理性核分裂，Ki-67 40%，inhibin(+)(图2)。术后患者高血压无明显缓解，病程中患者体质量一直稳定。2018年6月来北京协和医院就诊，查体：血压190/110 mmHg，体型正常，双下肢无水肿。生化及肾上腺激素检测结果见表1。复查CT提示左侧肾上腺区、膈肌上及腰大肌旁多发不规则占位病变。部分互相融合，最大截面6.3 cm x8.6 cm，内可见囊性坏死区及点状钙化(图1C)。18F-FDG-PET/CT示：左肾上腺区、膈肌及腰大肌旁不规则占位病变。放射性摄取增高，SUVmax 14.0；肝内可见多发放射性摄取增高灶，大小为0.8 cm，SUVmax 3.1；第3腰椎代谢增高灶，SUVmax 5.5，考虑ACC复发并多发肝转移、骨转移(图1D)。左肾上腺区占位穿刺病理学：肾上腺皮质癌。

2.2 肿瘤组织及外周血全外显子测序

患者外周血DNA中未发现已报道的与遗传性肾上腺皮质肿瘤及家族性醛固酮增多症相关的致病基因变异。

A.CT scan showed left adrenal mass in July 2014;B.in November 2017,CT showed multiple masses in left adrenal and left retroperitoneal area,suggesting tumor recurrence;C.in June 2018,CT revealed multiple irregular masses in left adrenal area,and near diaphragm and psoas muscle,part of which fused with each other,suggesting tumor recurrence after the second operation;D.in June 2018,18F-FDG-PET/CT indicated multiple liver and bone metastases图1 患者肿瘤的CT影像Fig 1 CT imaging of the tumor in the patient

A.HE staining (×200) showed significant increase in cell density and a higher ratio of nucleus to plasma.Cells were atypic with increased nuclear division;B.Ki-67 index was 40% (×100)图2 肿瘤的组织病理学特征Fig 2 Histopathological features of the tumor

肿瘤组织中共存在349个体系基因突变，突变基因主要富集在肿瘤发生和钙信号等通路上(图3)。未发现与醛固酮合成有关的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D和CACNA1H等基因体系突变。筛选出9个与肿瘤发生相关的致病基因,其中MSH6、CDKN2A和CTNNB1有相应的靶向治疗药物(表2)。

3 讨论

原醛腺瘤的发病与KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因的体系突变有关[5]，这些基因突变可导致离子通道或酶的异常，最终引起细胞内钙离子浓度升高，增加醛固酮合成酶表达，从而促使醛固酮分泌增加[2]。本例肿瘤中没有发现上述基因突变，但通过突变基因的通路富集，发现在钙信号通路上存在基因突变，是否其中有促进醛固酮分泌的新的致病基因还需要进一步研究以明确。本例患者肿瘤中存在CTNNB1基因突变。CTNNB1突变在醛固酮瘤(aldosterone-producing adenoma,APA)中已有报道。2007年首次发现9%(1/11例)的APA中存在CTNNB1突变[6]。CTNNB1突变后其编码的β-catenin 不会被有效降解。β-catenin堆积，转移到细胞核内，启动下游靶基因的转录，导致肿瘤的发生[7]。

表1 患者的实验室检查Table 1 Laboratory examination of the patient

图3 肿瘤体系突变基因的信号通路富集Fig 3 Pathway enrichment of the mutated genes in tumor

表2 与肿瘤发生相关的致病基因及靶向治疗药物Table 2 Pathogenic genes and molecular targeted drugs related to tumorigenesis

已知ACCs的发生与驱动基因突变有关，包括IGF2、CTNNB1、TP53、CDKN2A、PRKAR1A、RPL22、TERF2、CCNE1和NF1等[8]。对分泌醛固酮的ACCs的致病基因研究仅见一篇2019年的报道，研究发现分泌醛固酮的ACCs中存在CTNNB1、CDKN2A、PRKAR1A、ATM和RB1突变，这提示与其他ACCs相比，在分泌醛固酮的ACCs中并没有发现独特的分子肿瘤发生机制，ACCs和醛固酮的产生可能是由不同的机制引起[9]。本例肿瘤中也发现有CTNNB1和CDKN2A基因突变，CDKN2A编码肿瘤抑制蛋白p14ARF,p14ARF通过激活p53和抑制MDM2的表达来影响细胞周期的进程，CDKN2A突变后能促进细胞增殖和肿瘤生长。

除CTNNB1和CDKN2A基因突变外，本例肿瘤中还存在MSH6基因突变，为插入移码突变，且在肿瘤中发生频率高达80.6%。已报道MSH6突变与前列腺癌[10]、结直肠癌[11]及 Lynch综合征[12]等的发生相关。2012年最早发现Lynch综合征患者可发生ACCs,且ACCs中存在MSH6蛋白表达缺失[13]，2019年有研究显示，3.2%的Lynch综合征患者发生ACCs，同时ACCs可能是该综合征的唯一表现[14]。

ACCs的治疗非常棘手，靶向治疗是近几年的研究热点。本例ACC的驱动基因有相应的靶向治疗药物，如针对MSH6基因突变的靶向药物有氟尿嘧啶和纳武单抗等，针对CDKN2A基因突变的靶向药物有帕博西尼和瑞博西尼，针对CTNNB1基因突变的靶向药物有vantictumab，尽管还缺乏这些药物在ACCs中的使用经验，但提示了未来可能的研究和治疗方向。