雷公藤红素对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响及作用机制研究

马著妍，吴田田，吴彤，王悦，张蕴莉

（锦州医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 锦州 121000）

我国每年约有5.2 万女性被确诊为卵巢癌，约2.2万人死于卵巢癌，并且过去10年卵巢癌发病呈年轻化趋势[1]。卵巢癌具有易增殖、侵袭性高等特点，这也往往是临床治疗失效的原因，因此抑制卵巢癌细胞增殖及侵袭是治疗卵巢癌的要点与难点之一[2-3]。雷公藤红素是从我国传统中药雷公藤中提取的单体，具有良好的安全性。有学者前期研究发现，其抑制肿瘤血管生成、肿瘤增殖及侵袭效果较好[4-7]。同时有报道显示，肿瘤细胞发生凋亡可以有效抑制肿瘤生长[8-9]。 但是，雷公藤红素抑制肿瘤生长是否与细胞凋亡有关鲜有报道。因此，本研究以人卵巢癌细胞株HEYa8作为研究对象，研究雷公藤红素对HEYa8 细胞增殖和凋亡的影响，并探究其分子机制，以期为临床攻克卵巢癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

雷公藤红素购自上海Aladdin 公司，HEYa8 人卵巢癌细胞株购自美国ATCC 公司。培养基DMEM 及胎牛血清FBS 均购自美国Gibco 公司，MTT 试剂购自美国ThermoFisher 公司，IGF-1 购自美国R＆D 公司，GSDMS-N 购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18 及CD44 购自美国Abcam 公司，IL-1β、GAPDH、PI3K 及Akt 购自美国Cell Signaling Technology 公司。

1.2 HEYa8 人卵巢癌细胞株培养

将含有12%胎牛血清和1%青链霉双抗的DMEM 培养基培养HEYa8 细胞，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养，根据细胞生长状态换液及传代。

1.3 MTT 法测定雷公藤红素处理的最适浓度及时间

把雷公藤红素浓度分为8 个梯度，分别为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20 及2.40 mg/L（药物用培养基溶解），并分别作为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20 及2.40 mg/L 组。同时也把培养时间分为 5 个梯度，分别为0、12、24、48 及72 h。细胞进行 96 孔板铺板，边缘孔用无菌PBS 填充，每组设置6 个重复孔。隔夜培养后第2 天加入梯度药物，随后进行梯度时间培养。每组到时间后加入20μl MTT（5 mg/ml）培 养4 h，终止培养后吸去残液并加入150μl DMSO（37℃震荡10 min）。最后用酶标仪检测490 nm 波长处的吸光度值，得到的数值用Prism 7 软件处理。

1.4 实验分组

本实验分为对照组和雷公藤红素组，对照组为未经任何处理的HEYa8 人卵巢癌细胞，雷公藤红素组根据MTT 结果得到最适处理浓度及时间，应用雷公藤红素处理HEYa8 细胞。在机制实验部分，应用PI3K特异性激动剂（IGF-1）后，分为IGF-1（+）雷（+）组（同时加入IGF-1 和雷公藤红素）、IGF-1（-）雷（+）组（只加入雷公藤红素）和IGF-1（+）雷（-）组（只加入IGF-1）[10]。

1.5 Transwell 法测定细胞迁移、细胞分裂指数及细胞计数

在24 孔板配套的Transwell 小室里接种5×104个/ 孔细胞，用无血清培养基培养，小室以下孔板用血清培养基培养。培养12 h 后，利用0.1%结晶紫染色小室细胞，观察侵袭细胞的数量并拍照计数。细胞培养24 h 后，加入秋水仙素0.1μg/ml 后再培养40 min，随后显微镜下观察1 000 个细胞中分裂期细胞（洋葱状）数量，并用百分比表示。细胞培养24 h 后，用细胞计数仪分别测算两组细胞的数量。

1.6 Western blotting 检测

采用Western blotting 检测凋亡相关蛋白（GSDMS-N、Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18）和PI3K/Akt 信号通路关键节点蛋白（PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt）相对表达量。用预冷PBS 洗净细胞，再用RIPA+PMSF 裂解细胞并提取蛋白，之后进行制胶电泳及转模。孵育一抗过夜，GSDMS-N（1∶500），NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-18（1∶800），IL-1β、GAPDH、PI3K、Akt、p-PI3K 及p-Akt（1∶1 000），之后用TBST 洗净，再孵育相应二抗2 h，随后拍照。所得条带用Image J 软件分析，用Prism 7 软件处理数据。

1.7 免疫荧光双标检测

细胞先用PBS 洗净，随后用4%多聚甲醛溶液固定，再用3% Triton 孵育10 min，GSDMS-N（1∶1 000）过夜，第2 天用相应荧光二抗孵育后再用CD44（1∶1 000）孵育，用相应二抗孵育室温2 h，孵育10 min 的DAPI（1∶1 000）。最后用PBS 清洗，再用荧光显微镜拍照，数据用Image J 及Prism 7 软件分析处理。

1.8 qRT-PCR

采用Trizol 法提取细胞总RNA，逆转录，依据RevertAid RT Reverse Transcription Kit（美国Thermo Fisher 公司）试剂盒说明书将定量1μg 逆转录为cDNA，随后qRT-PCR 检测每组细胞内NLRP3、ASC、IL-1β 及Caspase 1 的表达量。NLRP3 正向引物： 5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'（21 bp），反向引物： 5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'（21 bp）， IL-1β 正向引物： 5'-CCTTGTGCAAGTGTCTGA AGC-3'（21 bp），反向引物： 5'-CCCAAGTCAAGGGCT TGGAA-3'（21 bp），ASC 正向引物： 5'-GACGGGGCCA ATACCACAC-3'（18 bp），反向引物： 5'-TCTGTAAC AAAAGTCGTGCTTCT-3'（23 bp），Caspase 1 正向引物： 5'-TGGGTGCAGGCACAATAAATG-3'（21 bp），反向引物： 5'-TTGAGGCAAGTTGAGGGTCTT-3'（21 bp），GAPDH 正向引物： 5'-TGTGGGCATC AATGGATTTGG-3'（21 bp），反向引物： 5'-ACACCA TGTATTCCGGGTCAAT-3'（22 bp）。qRT-PCR 反 应条件： 95℃预变性5 min，95℃变性30 s，37℃退火60 s，72℃延伸120 s，共计40 个循环。荧光半定量分析过程： 依次加入cDNA、引物及Q-PCR Mix，最后进行荧光半定量分析。数据采用Prism 7 软件处理。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度及培养时间雷公藤红素对HEYa8细胞生存率的影响

不同浓度雷公藤红素作用12、24、36、48 和72 h 的HEYa8 细胞生存率比较，经重复测量设计的方差分析，结果如下： ①不同时间点的细胞生存率比较，差异有统计学意义（F=135.130，P=0.000）； ②不同浓度组的细胞生存率比较，差异有统计学意义（F=74.860，P=0.000）；③不同浓度组的细胞生存率变化趋势比较，差异有统计学意义（F=2.604，P=0.043）。最终选择0.4 mg/L 浓度雷公藤红素处理24 h 来进行本实验。见表1和图1。

表1 不同浓度组各时间点细胞生存率比较 %

图1 不同浓度组的细胞生存率变化趋势 （±s）

2.2 雷公藤红素对HEYa8 细胞侵袭性及增殖性的影响

雷公藤红素组与对照组侵袭细胞、细胞分裂指数及细胞数量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），雷公藤红素组侵袭细胞、细胞总的数量较对照组少，而细胞分裂指数低于对照组。见表2和图2、3。

2.3 雷公藤红素对HEYa8 细胞凋亡的影响

雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），雷公藤红素组较对照组高（见表3和图4～6）。雷公藤红素组与对照组CD44/GSDMS-N 双阳性细胞占总细胞百分比分别为（38.33±6.0）%和（61.67±4.4）%，经t检验，差异有统计学意义（t=3.351，P=0.033），雷公藤红素组较对照组低。

表2 雷公藤红素组与对照组侵袭细胞、细胞分裂指数及细胞数量比较 （±s）

表2 雷公藤红素组与对照组侵袭细胞、细胞分裂指数及细胞数量比较 （±s）

组别 侵袭细胞/个 细胞分裂指数/% 细胞数量/个雷公藤红素组 97.70±9.28 27.33±4.48 523.3±233.3对照组 178.30±11.67 52.00±6.65 826.7±328.3 t 值 5.143 3.073 7.534 P 值 0.007 0.037 0.002

图2 雷公藤红素组与对照组侵袭细胞比较

图3 雷公藤红素组与对照组细胞分裂指数比较

表3 雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白相对表达量比较 （±s）

表3 雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 GSDMS-N Caspase 1 NLRP3 ASC IL-1β IL-18雷公藤红素组 0.90±0.03 0.94±0.04 0.88±0.04 0.91±0.04 1.03±0.09 0.95±0.07对照组 0.70±0.06 0.72±0.07 0.52±0.04 0.75±0.03 0.82±0.06 0.78±0.07 t 值 3.102 2.9137 3.875 3.302 2.607 2.573 P 值 0.043 0.038 0.021 0.029 0.041 0.030

图4 雷公藤红素组与对照组凋亡相关蛋白的表达

2.4 雷公藤红素对PI3K/Akt 信号通路的影响

雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt 信号通路关键分子的蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），雷公藤红素组较对照组低。见表4和 图7、8。

2.5 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 及蛋白相对表达量的变化

各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），IGF-1（+）雷公藤红素（+）组与IGF-1（-）雷公藤红素（+）组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组凋亡关键因子NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），IGF-1（+）雷公藤红素（+）组与IGF-1（-）雷公藤红素（+）组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5、6 和 图9～11。

图5 雷公藤红素组与对照组凋亡蛋白相对表达量比较 （±s）

图6 雷公藤红素组与对照组免疫荧光双标检测

表4 雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt 信号通路关键分子的蛋白相对表达量比较 （±s）

表4 雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt 信号通路关键分子的蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 PI3K Akt p-PI3K p-Akt雷公藤红素组 0.87±0.08 0.57±0.09 0.65±0.09 1.03±0.14对照组 1.46±0.12 1.20±0.15 1.13±0.09 1.57±0.12 t 值 3.914 4.359 3.910 2.828 P 值 0.017 0.012 0.017 0.047

图7 雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt 信号通路关键分子的蛋白相对表达量的变化 （±s）

图8 雷公藤红素组与对照组PI3K/Akt 信号通路关键分子蛋白的表达

表5 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相对表达量比较 （±s）

表5 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相对表达量比较 （±s）

组别 NLRP3 mRNA IL-1β mRNA ASC mRNA Caspase1 mRNA IGF-1（+）雷（+）组 1.12±0.04 1.12±0.07 1.25±0.19 1.38±0.08 IGF-1（-）雷（+）组 1.60±0.20 1.21±0.08 1.60±0.15 1.80±0.21 IGF-1（+）雷（-）组 0.85±0.03 0.97±0.07 1.00±0.16 0.90±0.08 F 值 9.133 4.100 4.197 12.22 P 值 0.006 0.049 0.047 0.002

表6 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相对表达量比较 （±s）

表6 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相对表达量比较 （±s）

组别 NLRP3 蛋白 IL-1β 蛋白 ASC 蛋白 Caspase1 蛋白IGF-1（+）雷（+）组 1.02±0.11 1.14±0.04 1.25±0.19 0.88±0.23 IGF-1（-）雷（+）组 2.10±0.46 1.77±0.26 1.60±0.15 1.60±0.25 IGF-1（+）雷（-）组 0.98±0.14 1.20±0.18 1.23±0.15 0.83±0.08 F 值 11.283 4.672 5.349 7.914 P 值 0.004 0.04 0.038 0.019

图9 各组蛋白的表达

图10 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 相对表达量的变化 （±s）

图11 各组NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相对表达量的变化 （±s）

3 讨论

卵巢癌因其恶性程度高、侵袭性强等特点，并且一般临床发现已到中晚期，留给患者的选择几乎只有手术与化疗[1-2]。雷公藤红素是具有多种生物活性的天然产物，来源于传统中药雷公藤的根皮，应用历史甚久，毒副作用较弱，目前主要应用在抗癌的抑制肿瘤血管新生方面[3]。虽然何冰玉等[6]和张亚南等[7]前期研究发现，雷公藤红素具有良好的抑制卵巢癌生长的作用，然而抗癌的分子机制还不甚明了。

细胞凋亡是一种新型程序性细胞死亡方式[11]。有研究表示，提高肿瘤细胞凋亡水平可以有效抑制肿瘤生长与增殖，肿瘤细胞凋亡可能是抑制肿瘤细胞生长增殖的新方向[12]。有学者研究发现，提高卵巢癌细胞的凋亡水平可有效抑制肿瘤细胞的侵袭、生长与分裂，这可能与细胞凋亡后α-NETA 杀伤活性被激活等因素有关[13]。笔者研究发现，用雷公藤红素最适合治疗浓度作用HEYa8 细胞，可以降低细胞侵袭性，减少细胞分裂指数并减少总的细胞数量，这与前期研究结果基本吻合，证明了雷公藤红素确实有抑制卵巢癌细胞生长的作用。随后发现，在雷公藤红素作用下细胞凋亡关键因子Caspase 1 水平升高，这可能与雷公藤红素诱导HEYa8 细胞凋亡有关。因为细胞凋亡是一种依赖于Caspase 1 的细胞死亡，Caspase 1 在凋亡中扮演重要角色[14]。其中前体Caspase 1 需要通过NLRP3 小体（包括NLRP3 及ASC 等分子）的切割才能转化为具有活性的Caspase 1，并且Caspase 1 的作用主要是在于活化IL-1β 和IL-18，从而激活细胞自身的炎症反应[15]。然而，IL-1β 和IL-18 等炎症因子还受到GSDMD 的控制，GSDMD 活化成为GSDMD-N后，可以在细胞膜上形成孔道，使细胞内炎症内容物外放[16]。炎症内容物外放后可以导致肿瘤细胞的增殖被抑制，甚至死亡，这也是很多研究报道的细胞凋亡与肿瘤被抑制的机制[12-13]。同样的，笔者发现雷公藤红素可以较好地提升凋亡相关蛋白的水平，也提高了GSDMD-N 阳性细胞的比例，这些都说明雷公藤红素可以提高肿瘤细胞凋亡水平。有研究报道，细胞凋亡的发生可能与经典的PI3K/Akt 信号通路相关，即抑制此信号通路可以有效提高细胞凋亡水平[17-19]。笔者发现雷公藤红素在HEYa8 细胞中可以抑制此信号通路，并且用PI3K 特异性激活剂（IGF-1）激活此通路后，雷公藤红素的促细胞凋亡作用消失，这提示雷公藤红素诱导细胞凋亡可能抑制了PI3K/Akt 信号通路。

综上所述，雷公藤红素具有较好的HEYa8 细胞抑制作用，引起此现象是因为雷公藤红素激活了肿瘤细胞的凋亡，这个过程可能与其抑制PI3K/Akt 信号通路高度相关。然而，本实验的分子机制研究依旧有限，缺乏深层次的在体研究等，还需要进一步实验探索。