慢性牙周炎患者外周血单核细胞Notch1 mRNA的表达及与疾病严重程度的相关性

付海标，闫俊杰

（1.浙江中医药大学研究生院，浙江 杭州 310053；2.丽水市人民医院 口腔科，浙江 丽水 323000）

慢性牙周炎为常见的口腔疾病，可导致牙槽骨、牙骨质、牙周膜和牙龈等牙周组织发炎，为一种长期感染性疾病。细菌菌斑在牙周的定殖可引起牙周慢性炎症，导致牙槽骨和结缔组织破坏，最终造成牙齿脱落。牙龈卟啉单胞菌、厌氧链球菌、中间型小球藻等厌氧菌为常见致病菌。慢性牙周炎的典型表现为免疫炎症反应。慢性牙周炎患者牙菌斑中的厌氧菌等致病菌可引起宿主发生免疫反应和炎症反应，造成牙周组织的破坏；这些免疫炎症反应释放的炎症细胞因子进入外周血，对全身各系统产生一定影响，可导致糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）等疾病。辅助性T 细胞17（helper T cells 17,Th17）在慢性牙周炎的发病中发挥重要作用[1]。Th17 在健康人群外周血中也存在，主要参与维持机体内环境稳定，产生免疫应答，协助机体清除异物抗原，且不损伤人体自身组织。在牙菌斑的作用下，Th17 等T 细胞水平升高，介导细胞免疫应答为主的多种致炎因子水平升高，参与慢性牙周炎的发生[2]。白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）由Th17 细胞产生，具有非常强的致炎作用。在牙周炎时，辅助性T 细胞在牙周组织破坏阶段通过诱导Th17 等细胞释放IL-17 等致炎因子参与炎症反应过程[3]。IL-17 作为一种强大的致炎因子，参与牙周组织的炎症反应过程，且随着炎症程度的加重，IL-17 水平升高，IL-17 水平在一定程度上可反映慢性牙周炎的严重程度[4]。有研究发现慢性牙周炎患者龈沟液和血浆中辅助性T 细胞及其细胞因子IL-17 水平升高，认为Th17 在牙周炎的发病过程中可能发挥促炎作用[5-6]。Th17 细胞的分化受多种信号通路调控，其中Notch 信号通路是调控细胞分化的重要通路[7-8]。有研究发现Notch 信号通路在Th17 细胞的分化中发挥重要作用[9]。但Notch 在慢性牙周炎患者外周血中的表达水平及其是否对Th17 细胞分化具有调控作用尚不清楚。本文对慢性牙周炎患者外周血单核细胞Notch1 mRNA 表达与Th17 细胞和疾病严重程度的关系进行研究，阐明其在慢性牙周炎中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2018年12月丽水市人民医院口腔科收治的慢性牙周炎患者150 例作为观察组，另取同期本院150 例健康体检者作为对照组。观察组根据病情严重程度[10]分为轻度组54 例，中度组51 例， 重度组45 例。观察组男性77 例，女性73 例；年龄24 ～53 岁，平均（43.25±7.34）岁；体重指数（2.42±0.23）kg/m2。对照组男性75 例，女性75 例；年龄25 ～54 岁，平均（44.12±7.18）岁；体重指数（2.37±0.21）kg/m2。两组年龄、性别、体重指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：年龄20 ～60 岁，临床数据和资料完整，签署知情同意书，依从性好，接受正规治疗。

排除标准： 吸烟；妊娠期或哺乳期女性；糖尿病、高血压、类风湿关节炎等其他疾病；侵袭性牙周炎；急慢性感染性疾病；免疫系统疾病；影响Notch1 水平的其他口腔疾病；接触放射线；服用抗菌药物、激素类药物、免疫制剂。

1.2 方法

1.2.1 慢性牙周炎患者治疗方法采用牙周基础治疗，包括口腔卫生指导、口腔洁治、龈下刮治，治疗后6 周复查。

1.2.2 标本采集采集慢性牙周炎患者治疗前后外周静脉血，以及健康体检者体检当天外周静 脉血。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定外周血Notch1 mRNA采用Ficoll 密度分离法分离两组患者外周血单个核细胞，参照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA，进行qRT-PCR。反应条件： 94℃预变性60 s，94℃变性10 s、56℃退火10 s、72℃延伸30 s，共40 个循环。以2-ΔΔct法计算Notch1 mRNA。Notch1正向引物： 5'-GTCAACGCCGTAGATGACC-3'，反向引物： 5'-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3'， 长 度101 bp。qRT-PCR 试剂购自日本TaKaRa 公司。

1.2.4 外周血Th17 细胞、IL-17 水平测定采用流式细胞仪测定外周血Th17 细胞水平，采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定外周血IL-17 水平。ELISA 试剂盒购自美国Sigma 公司。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或配对t检验；相关性分析用Pearson 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较

两组外周血Notch1 mRNA表达及Th17细胞、IL-17水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组高于对照组（见表1）。Notch1 mRNA 扩增曲线和熔解曲线见图1、2。两组外周血Th17 细胞流式细胞图见图3。

表1 两组外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （n =150，±s）

表1 两组外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （n =150，±s）

组别 Notch1 mRNA Th17 细胞/% IL-17/（pg/ml）对照组 1.00±0.06 0.51±0.11 0.61±0.13观察组 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12 t 值 68.586 41.481 9.692 P 值 0.000 0.000 0.000

图1 Notch1 mRNA 扩增曲线

图2 Notch1 mRNA 熔解曲线

图3 两组外周血Th17 细胞的流式细胞图

2.2 不同严重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较

不同严重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；中度组和重度组高于轻度组（P＜0.05），重度组高于中度组（P＜0.05）。见表2。

表2 不同严重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （±s）

表2 不同严重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （±s）

注： ①与轻度组比较，P ＜0.05；②与中度组比较，P ＜0.05。

组别 n Notch1 mRNA Th17 细胞/% IL-17/（pg/ml）轻度组 54 1.27±0.07 0.87±0.14 0.68±0.11中度组 51 1.53±0.08① 1.11±0.15① 0.77±0.12①重度组 45 1.72±0.09①② 1.24±0.16①② 0.87±0.10①②F 值 398.394 78.944 36.174 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 治疗前后外周血Notch1 mRNA 表达及Th17细胞、IL-17 水平比较

慢性牙周炎患者治疗前后外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较，经配对t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗后低于治疗前。见表3。

表3 治疗前后外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （n =150，±s）

表3 治疗前后外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平比较 （n =150，±s）

时间 Notch1 mRNA Th17 细胞/% IL-17/（pg/ml）治疗前 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12治疗后 1.12±0.09 0.63±0.13 0.64±0.11 t 值 58.876 93.081 67.361 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 慢性牙周炎患者治疗前外周血Notch1 mRNA表达与Th17 细胞、IL-17 水平的相关性

慢性牙周炎患者治疗前外周血Notch1 mRNA 表达与Th17 细胞、IL-17 水平呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 慢性牙周炎患者治疗前外周血Notch1 mRNA 表达与Th17 细胞、IL-17 水平的相关性

3 讨论

慢性牙周炎是牙周组织破坏的主要原因，为牙周软组织的炎症状态及对牙齿菌斑的直接免疫反应[11]。慢性牙周炎为难治性疾病，是导致成人牙齿缺失的主要原因。慢性牙周炎也增加冠心病、低出生体重儿等的发生风险，对人类健康造成危害。随着免疫学的发展，大量研究证实慢性牙周炎是一种由T 细胞介导的、细胞免疫应答为主的、多种致炎因子共同参与的慢性炎症性疾病[2]。

本研究结果表明，慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表达及Th17 细胞、IL-17 水平升高，外周血Notch1 mRNA 表达与Th17 细胞、IL-17 水平呈正相关。Notch 家族为一种十分保守的跨膜蛋白，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在[12]，在胚胎形成、免疫细胞分化及功能调节、细胞增殖和凋亡方面发挥重要作 用[13-14]。Notch 家族可通过Notch1 在Th17 细胞分化中发挥调节作用，在类风湿关节炎、过敏性哮喘等常见自身免疫性疾病中发挥重要作用[15-16]，如呼吸道合胞病毒通过激活Notch1 促进气道微环境中Th17 细胞的分化[17]；Notch1 信号可促进银屑病患者外周血Th17细胞分化[18]。张黎等[19]通过动物实验发现，Notch1信号通路在慢性牙周炎大鼠的免疫平衡调控中发挥重要作用。结合本研究结果及既往研究分析，Notch1 mRNA 可能通过促进Th17 细胞分化诱导免疫炎症反应，参与慢性牙周炎的发病过程。

本研究中随着慢性牙周炎严重程度增加，外周血Notch1 mRNA 表达升高，治疗后随着牙周炎的控制，外周血Notch1 mRNA 表达降低，表明其在一定程度上可反映慢性牙周炎的病情严重程度，病情越严重，免疫炎症反应越显著，Notch1 mRNA 表达越高，通过调控Th17 细胞分化，导致IL-17 等促炎细胞因子水平升高，进一步加重病情发展。

Notch1 mRNA 可促进Th17 细胞分化，但其机制尚不清楚，探讨Notch1 mRNA 促进Th17 细胞分化的机制将是下一步需要研究的内容。