翻白草4种提取物的体外抑菌活性研究

仁科

（四川省若尔盖县藏兽医药研究所，四川 若尔盖 624504）

翻白草始载于《救荒本草》，是一种常见中药［1］，又名鸡腿儿、鸡腿根、鸡脚草、鸭脚参，为蔷薇科委陵菜属植物“翻白草”的干燥全草。翻白草性平、味甘、微苦、无毒，归肝、胃、大肠经，具有止血止痢、清热解毒、消肿之功效，常用于赤痢腹痛、久痢不止、咳血、吐血、大便带血、崩漏、肺痈、痈肿及结核等［2］。相关研究也表明，翻白草具有抗菌、止泻、免疫抑制、降血糖和抗肿瘤作用［3-5］。由于翻白草的提取物有特殊的药理学活性，关于翻白草的化学成分已有大量研究，据报道其化学成分主要有黄酮类、三萜类、鞣质类等［6-8］。对翻白草化学成分的研究起始于上世纪30年代，主要分离到的是多烯类化合物、黄酮和β-胡萝卜素。中国科学院昆明植物研究所首次从翻白草的甲醇提取物中分离得到6 个化合物，分别为黄酮类和三萜类化合物［9］。其中黄酮类化合物的毒副作用小，不仅可以降低血糖，其清热解毒作用还可提高机体免疫功能，防止糖尿病并发症的发生，由于其价格低廉，很有开发价值［10］。

近年来，随着半合成和合成抗菌药物的广泛开发和应用，细菌耐药性问题日趋严重。面对这一严峻现状，国内外越来越多的学者在各种中草药成分抗菌活性方面展开了相关研究，同时期望从中草药中得到更加理想的抗菌药物［11-13］。因此，系统地研究中药的抑菌活性，进一步开发新的抗菌药物对合理利用我国宝贵的中药植物资源具有十分重要的意义。

基于此，本研究以去离子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚为溶剂，分别对翻白草全草进行提取，然后以10种细菌标准株为研究对象，分析不同溶剂提取的主要活性成分对细菌的抑制情况，以期为翻白草药用价值的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材来源 翻白草采于河南省唐河县城西丘陵地带，经鉴定为蔷薇科委陵菜属植物“翻白草”全草。药材采集后洗净泥沙，晾干、粉粹备用。

1.1.2 供试菌株 普通变形杆菌（10491-1）、肺炎克雷伯氏菌（1.10612-1）、痢疾志贺氏菌（1.1869-1）、肠沙门氏菌肠亚种（1.10754-1）、粘质沙雷氏菌（1.4256-1）、金黄色葡萄球菌（50094-1a2）、F菌（粪肠球菌ATCC25912）、S菌（屎肠球菌ATCC35667）、阪崎肠杆菌（1.6765-1）、阴沟肠杆菌阴沟亚种（1.2022-3）等10 种标准菌株由西南民族大学兽医药理实验室保存和提供。

1.1.3 主要仪器及培养基 无菌操作台、隔热式电热恒温培养箱、旋转蒸发仪等，均由西南民族大学兽医药理学实验室提供。所用培养基为TSA培养基、MH肉汤、MH肉汤琼脂培养基，临用前参照说明书配制。

1.2 方法

1.2.1 翻白草提取物的制备 准确称取粉碎的翻白草200 g，分别浸泡于2 L不同提取溶剂（去离子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚）中，用旋转蒸发仪回流提取3 次浸取液。每次浸泡48 h，旋蒸至棕褐色浸膏为止，转数控制在90 r/min，温度控制在50 ℃左右。

1.2.2 生化反应和薄层层析 准确称取实验室备用的翻白草粉剂10 g，浸泡于100 mL 去离子水溶液中，浸泡48 h 后过滤备用。取若干灭菌试管，在试管中加入适量翻白草滤液，然后加入各类理化检测试剂进行植物化学成分的分析鉴定。取层析缸，以石油醚∶乙酸乙酯（1∶10，V/V）为展开剂，在硅胶板上点样后放入层析缸中，展开后在紫外灯下观察记录有无荧光，喷上显色剂后再在紫外灯下观察荧光情况。

1.2.3 翻白草不同提取物最小抑菌浓度（MIC）的测定 参照CLSI（临床实验室标准化协会，2013 版）指导原则和执行标准，采取微量肉汤稀释法测定翻白草4 种溶剂提取物对10 种标准菌株的体外抑菌敏感性。步骤如下：将MH 肉汤按照每孔100 μL加入96 孔板的1～12列，然后第1列的分别加入100 μL 不同提取溶剂（去离子水、甲醇、乙酸乙酯和石油醚）的提取物，按照倍比稀释法操作，依次将第1 列每孔稀释物加至2～11列，然后在1～11列各孔加入菌悬液，以不加菌悬液的第12 列为阴性对照，37 ℃培养24 h 后观察MIC 结果。所有阴性对照孔的培养基澄清，说明本实验方法可行。以抑制细菌生长的翻白草提取物的最高稀释浓度作为翻白草提取物的最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.4 翻白草不同提取物的抑菌圈测定 采用纸片法测量抑菌圈直径，方法如下：在无菌工作台中，取多个MH肉汤琼脂培养基，分别加入1种标准菌株的悬菌液30 μL，涂布均匀，做好标记；每个培养基中均匀放置4 个经高压蒸汽灭菌过的空白药敏片，在培养基外壁药敏片对应的位置分别标记1、2、3、4，在位置1 的药敏片上均滴上10 μL 去离子水提取物，在位置2 的药敏片上均滴上10 μL 石油醚提取物，在位置3 的药敏片上均滴上10 μL 甲醇提取物，在位置4 的药敏片上均滴上10 μL 乙酸乙酯提取物；然后置37 ℃恒温培养箱中培养12 h，观察并测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 植物化学成分分析鉴定 采用生化反应和薄层层析对提取物进行活性成分鉴定。结果得出：翻白草提取物中含有三萜类、甾体类、酚类、鞣质类和黄酮类等活性成分（见表1和表2）。

表1 翻白草水提物活性成分化学反应鉴定结果

表2 翻白草水提物活性成分薄层层析鉴定结果

2.2 体外抑菌试验 翻白草4 种溶剂提取物对10 株标准菌株的体外抑菌结果如表3 和表4 所示。结果表明，翻白草提取物对试验菌株均有抑制作用，其中石油醚提取物对粪肠球菌ATCC25912 和屎肠球菌ATCC35667 的最小抑菌浓度最低。

3 小结

本试验采用生化反应法和薄层层析法鉴定了翻白草的化学成分，结果表明翻白草中含有黄酮类、酚和鞣质类、三萜和甾体类等化学成分。抑菌试验表明翻白草全草的去离子水、甲醇、乙酸乙酯、石油醚提取物对供试的10 种细菌均存在不同程度的抑制作用，说明翻白草具有较好的抗菌活性。对不同提取溶剂的体外抑菌效果进行比较，在微量肉汤稀释法中，4 种溶剂提取的翻白草活性成分的抑菌效果相当，其中石油醚提取物对S菌（屎肠球菌ATCC35667）、F菌（粪肠球菌ATCC25912）有明显的抑制效果；在纸片扩散法中，去离子水、甲醇、乙酸乙酯三种提取物的抑菌效果相当，且都高于石油醚提取物的抑菌效果。

表3 翻白草4种溶剂提取物对10种标准菌株的体外最小抑菌浓度（MIC）

表4 翻白草4种溶剂提取物对10株标准菌的抑菌圈直径（d）

上述两种抑菌试验中，由于96孔板相邻两孔的浓度差很大，故不能得出确切的抑菌浓度；纸片法中因为药液在扩散时快慢不一，故对翻白草抑菌结果的评价存在一定的误差。