2019年夏季成都市病死猪繁殖与呼吸综合征感染情况分析

黄迪，李敏，周潇潇，周紫峣，向晓雪，岳建国*

（1.四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性、高度接触性传染病，又称猪蓝耳病。我国农业农村部将该病列为二类动物传染病［1］。其主要临床症状如下：妊娠母猪发生流产、早产、产木乃伊胎和死胎等严重繁殖障碍，各年龄段猪发生呼吸障碍［2］。近年来临床症状趋于复杂，且多表现为混合感染，加大了该病诊断的难度［3］。PRRS具有发病急、传播快、流行广、病死率高等特点，自上世纪90 年代传入我国以来，至今仍未被清除，给我国生猪养殖业带来了持续威胁。2019年6～9月，笔者采用荧光定量PCR方法对成都市三个无害化处理厂的237 份组织病料样本进行PRRSV 核酸检测，旨在了解成都市养殖场中PRRS的发病情况，以期为成都市PRRS流行病学调查和疫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 样品采集于成都市无害化处理厂，来源于成都市15 个市（区）县，共抽检采样猪淋巴组织237份。

1.1.2 主要试剂 磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒，购自北京世纪元亨生物技术有限公司；猪蓝耳病病毒通用型单重荧光PCR检测试剂盒，购自北京亿森宝生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 取2 mL 无菌Lysing Matrix 组织研磨管，加入1 mL PBS 液，再加入适量淋巴组织样品，置于FastPrep-24™5G 研磨仪，研磨30 s后取下研磨管，置于离心机8 000 r/min离心1 min，取上清保存于-20 ℃备用。

1.2.2 RNA抽提 参照磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，配合KingFisher DUO自动化提取仪器，执行Tian_KingFisher_Duo.bdz 程序进行DNA 抽提。程序执行完毕，取出DNA，用封口膜封好保存于-20 ℃备用。

1.2.3 反转录-聚合酶链式反应 从试剂盒中取出荧光qRT-PCR 反应液（PRRSV-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振荡混匀后，10 000 r/min离心10 s。

PCR 反应管内依次加入荧光PCR 反应液14 μL，酶混合物1 μL，处理后样品或阴性对照（NTC）、阳性对照（PRRSV-PTC）5 μL，配制成20 μL 的qRT-PCR 反应体系，10 000 r/min 离心10 s。将各反应管放入实时荧光PCR仪器反应槽内，循环条件如下：

第一步：反转录，45 ℃10 min，1个循环；第二步：预变性，95 ℃10 min，1 个循环；第三步：PCR扩增，95 ℃15 s、60 ℃45 s，40 个循环。在60 ℃延伸时收集荧光信号，报告基团：FAM，淬灭基团：NONE。

1.3 结果判定 直接读取检测结果。基线和阈值设定原则依据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

在试验成立的条件下，Ct值≤35 的样本为阳性，表明PRRSV 核酸阳性；Ct值显示为“None”的样本为阴性，表明PRRSV 核酸阴性；如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。

2 结果与分析

检测结果见表1。共检测病死猪淋巴组织样本237 份，结果得出PRRSV 阳性样本有10 份，阳性率为4.22%。

表1 2019年夏季成都市病死猪繁殖与呼吸综合征qRT-PCR检测结果

3 讨论

3.1 蓝耳病防控现状及建议 由于PRRS 的高传染性、高致病性，使得我国PRRS的防控形势依然严峻。为有效控制PRRS，相应的生物安全措施必不可少。控制PRRS的核心环节是稳定种猪群［4］。鉴于PRRSV 具有高度变异、易重组、毒株类型复杂的特点，各养殖场户应重视闭群环节。PRRSV 阳性猪场应淘汰阳性种猪，停止引种，坚持自繁自养；阳性和阴性猪群应做好隔离消毒；猪只引种和运输要严格检疫，防止病毒引入和扩散；提高人员生物安全意识，严格执行生物安全标准；保证圈舍干燥通风、温度适宜，将感染风险降到最低。

防控PRRS 的另一核心环节则是合理、科学地使用疫苗。部分养殖场户因疫苗选用不当、接种计划制定不合理以及灭活苗、弱毒苗滥用，加速了PRRSV 毒力返强和毒株间重组，导致PRRS疫情仍有散发并有多发趋势［5］，也为我国PRRS的防控和净化带来了较大难度。

3.2 蓝耳病防控目标 为了进一步加强动物疫病防控工作，农业农村部、财政部曾联合印发了《关于调整完善动物疫病防控支持政策的通知》，高致病性猪蓝耳病暂不实施国家强制免疫政策。遵照通知要求，阴性养殖场户应杜绝PRRS免疫接种；稳定感染的养殖场户不建议进行免疫接种；不稳定感染养殖场户，应先做好周边区域的流行病学调查，明确当地流行毒株，排查生物安全隐患，进而选择相应毒株的弱毒苗按照适当的免疫计划进行免疫。免疫方式和时间，受生产者的目标影响，如果生产者的目标是实现场户内PRRSV 净化，则最终应停止PRRSV 疫苗的免疫［6］。

目前我国正处于非洲猪瘟等动物疫病防控的关键时期，各养殖场户应重视生物安全防护，严格执行生物安全规程；相关部门应遵照农业农村部印发的《国家高致病性蓝耳病防治指导意见（2017-2020年）》，严格落实免疫预防、检测净化、检疫监管、应急处置、无害化处理等综合防控措施，积极开展场群或区域净化工作。成都地区力争在2020 年底实现市内核心育种场达到净化标准，其他养殖场户达到稳定控制标准的防治目标。本研究结果对各区（市）县养殖场户的PRRS感染情况进行了摸底，为成都市PRRS 流行病学调查和疫情防控提供了科学参考。本研究仅对PRRSV进行了通用型单重荧光PCR检测，如需进一步确定各养殖场户的流行毒株（如经典PRRSV、HP-PRRSV），则应进一步对相关病原进行分子生物学检测。

4 结论

本研究表明，2019 年夏季在成都市抽检的237 份猪淋巴组织样品中，仍有PRRSV 阳性检出，综合阳性率为4.22%，表明成都市各区（市）县养殖场户中仍散在蓝耳病毒。