lncRNA DLX6⁃AS1通过靶向miR⁃16⁃5p/NUCKS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431增殖、迁移和侵袭

郑云鹏 蔡丙杰 李旭阳 李冬芹 尹光文

郑州大学第一附属医院皮肤科450052

长 链 非 编 码RNA（long non ⁃ coding RNAs，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）均属于非编码RNA，均参与肿瘤的发生发展过程［1］。皮肤鳞状细胞癌（简称皮肤鳞癌）是常见的皮肤恶性肿瘤［2］，手术、放疗和化疗联合治疗是晚期皮肤鳞癌的经典治疗方式，靶向和免疫治疗是其治疗的新方式［3］。研究表明，lncRNA、miRNA可能在皮肤鳞癌的发生、转移中发挥作用［4⁃5］。有报道显示，长链非编码生长停滞特异性蛋白6 反义RNA1（growth stasis specific protein 6 antisense RNA 1，lncRNA DLX6⁃AS1）在多种恶性肿瘤中高表达，其高表达与细胞增殖和侵袭有关［6⁃7］，但lncRNA DLX6⁃AS1在皮肤鳞癌中的作用尚不清楚。miR⁃16⁃5p在乳腺癌［8］和肾癌［9］中低表达，影响癌细胞的增殖、迁移和侵袭。核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1（nuclear ubiquitous casein and cyclin ⁃ dependent kinase substrate1，NUCKS1）在胃癌中高表达，可促进癌细胞的侵袭［10］。我们通过在线工具starBase预测发现，lncRNA DLX6⁃AS1和miR⁃16⁃5p存在结合位点，且NUCKS1可能是miR⁃16⁃5p的靶基因，然而miR⁃16⁃5p和NUCKS1在皮肤鳞癌中的表达和作用尚不清楚。因此，我们探讨lncRNA DLX6⁃AS1靶向miR⁃16⁃5p/NUCKS1对皮肤鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

材料与方法

一、材料

人皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞（细胞株号CVCL_0038）和皮肤鳞癌A431 细胞（细胞株号CVCL_0037）产自美国模式培养物集存库。DMEM高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（美国Hyclon 公司），NUCKS1抗体、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、基质金属蛋白酶（MMP）2 抗体和MMP9 抗体（美国Santa cruze公司），山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP，北京百奥莱博科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂、Total RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR［qRT⁃PCR试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司］，双荧光素酶报告系统（dual⁃luciferase reporter assay system）（美国Promega 公司），lncRNA DLX6⁃AS1 抑制物（si⁃DLX6⁃AS1，5′⁃GATCGTAGGCTAACACATCCATGG AATCAAGAGTTCCATGGATGTGTTAGCCTATTTTT TGA⁃3′）、miR⁃16⁃5p 模拟物（miR⁃16⁃5p，5′⁃GCGGTTATAAATGCACGACGAT⁃3′）、miR⁃16⁃5p抑制物（anti⁃miR⁃16⁃5p，5′⁃CACCAATATTTACGTGCT GCTA⁃3′）、NUCKS1抑制物（si⁃NUCKS1，5′⁃GAAGG TTGTTGATTACTCACAGTTT ⁃ 3′）和 相 应 对 照［DLX6⁃AS1⁃NC（5′⁃GATCGATCCGATGTCGGTATA AGAACTCAAGAGGTTCTTATACCGACATCGGATT TTTTTGA⁃3′）、miR⁃NC（5′⁃ATTTGCCAGGTCGGAA TG⁃3′）、anti⁃miR⁃NC（5′⁃UCACAACCUCCUAG AAAGAGUAGA⁃3′）、NUCKS1⁃NC（5′⁃CTAGTACTT ACGTTATGGAAGTTTG⁃3′）］（上海吉玛制药有限公司），细胞培养板（美国Corning公司），CCK8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、β肌动蛋白抗体（上海碧云天生物技术有限公司），全自动酶标仪和Real⁃time PCR仪（美国Bio⁃Rad公司）。

二、细胞培养

将A431细胞和HaCaT细胞分别培养在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM高糖培养液中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每2天换液1次，1∶3消化传代。

三、qRT⁃PCR 检测lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p和NUCKS1mRNA的表达

取对数生长期HaCaT 和A431 细胞，用Total RNA提取试剂盒提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，然后以cDNA 为模板，按照实时荧光定量PCR 试剂盒说明书操作，以U6 或GAPDH为内参，检测lncRNA DLX6⁃AS1、miR ⁃ 16 ⁃ 5p 和NUCKS1 mRNA的表达。引物由上海吉玛制药有限公司合成，序列见表1。反应条件为：95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40 个循环。使用2-ΔΔCt法分析HaCaT和A431细胞中lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p和NUCKS1 mRNA的相对表达。

四、Western 印 迹 检 测NUCKS1、Cyclin D1、MMP⁃2和MMP⁃9蛋白的相对表达水平

取对数生长期HaCaT 和A431 细胞，裂解液裂解细胞，提取总蛋白，使用BCA 法对蛋白进行定量。目的蛋白沸水浴变性处理，取上清液上样电泳，经转膜、封闭后，将膜转移至NUCKS1 抗体、Cyclin D1抗体、MMP2抗体、MMP9抗体和β肌动蛋白抗体（1∶1 000 稀释）溶液，于4 ℃孵育过夜，用磷酸盐吐温缓冲液洗膜3 次，将膜转移至相应的山羊抗兔IgG⁃HRP二抗稀释液（1∶1 000）中，孵育2 h。通过超敏ECL发光试剂盒显影、定影、曝光。使用Quantity One 4.6 软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带与β肌动蛋白条带的比值表示蛋白的相对表达水平。

五、双荧光素酶报告系统实验

用starBase 预测DLX6⁃AS1 与miR⁃16⁃5p 及miR⁃16⁃5p 和NUCKS1 之间的互补序列，根据互补序列设计合成有互补结合位点的WT⁃DLX6⁃AS1、WT⁃NUCKS1序列和无互补结合位点的MUT⁃DLX6⁃AS1、MUT⁃NUCKS1 序列（图1），并通过DNA 连接酶将其克隆至荧光载体上，构建荧光素酶报告基因质粒（上海吉玛制药有限公司），根据Lipofectamine 2000 转染试剂说明书，分别与miR⁃16⁃5p、miR⁃NC共转染至A431 细胞，转染48 h 后按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒要求操作，检测细胞的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以二者的比值表示报告DLX6⁃AS1基因的表达水平。

六、调节DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p、NUCKS1 的表达对A431细胞的影响

用胰蛋白酶消化对数生长期A431细胞，以1×l06/ml 接种于6 孔板，根据Lipofectamine 2000 转染试剂说明书，转染si⁃DLX6⁃AS1、si⁃NUCKS1 干扰A431细胞DLX6⁃AS1、NUCKS1表达，分别转染miR⁃16⁃5p、anti⁃miR⁃16⁃5p 上调和敲减A431 细胞miR⁃16⁃5p 的表达，转染8 h 后更换培养基，继续培养48 h，采用qRT⁃PCR和Western 印迹检测转染效率，确定转染成功后用于后续实验研究。

表1 实时荧光定量逆转录PCR引物信息

图1 根据长链非编码RNA DLX6⁃AS1 与微小RNA⁃16⁃5p（miR⁃16⁃5p）之间和miR⁃16⁃5p与NUCKS1之间的互补序列设计的序列 1A：长链非编码RNA DLX6⁃AS1与微小RNA⁃16⁃5p（miR⁃16⁃5p）之间的互补核苷酸序列；1B：miR⁃16⁃5p与NUCKS1之间的互补核苷酸序列。WT序列为有互补结合位点的序列；MUT序列为无互补结合位点的序列

1.干扰DLX6⁃AS1表达对A431细胞的影响：取转染si⁃DLX6⁃AS1、DLX6⁃AS1⁃NC 的A431 细胞，采用qRT⁃PCR 检测miR⁃16⁃5p、NUCKS1 mRNA 的表达，CCK8实验检测细胞存活率，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western 印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP⁃9的相对表达水平。

CCK8实验：取各组A431细胞，稀释为2×104/ml，以100 μl/孔接种于96 微孔板中，每孔加入10 μl CCK8溶液，在培养箱中培养2 h，酶标仪测定450 nm吸光度（A 值）。细胞存活率=实验组A 值/对照组A值×100%。

Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力：迁移实验中，取各组A431 细胞，弃上清液，用无血清培养液重悬细胞，饥饿培养过夜，收集细胞，稀释为2×105/ml，取100 μl 细胞加入Transwell 上层小室，下层加入含胎牛血清的DMEM 培养液，培养24 h，棉签拭去上层小室未迁移的细胞，采用甲醛固定迁移细胞，结晶紫染色，拍照，显微镜下计数10个200倍视野，计算各组的迁移细胞均数。侵袭实验中，将Transwell 上层小室的培养液更换为1∶6 比例稀释的Matrigel基质，余步骤同迁移实验。

2.过表达miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响：取转染miR⁃16⁃5p、miR⁃NC的A431细胞，采用qRT⁃PCR检测miR⁃16⁃5p 的表达，CCK8 实验检测细胞存活率，Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western 印迹法检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9的相对表达水平。

3. 敲低NUCKS1 对A431 细胞的影响：取转染si⁃NUCKS1、NUCKS1⁃NC 的A431 细胞，分别采用CCK8 实验检测细胞存活率，Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western 印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9的相对表达水平。

4.低表达lncRNA DLX6⁃AS1后敲减miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响：取转染si⁃DLX6⁃AS1后分别转染anti⁃miR⁃16⁃5p、anti⁃miR⁃NC 的A431 细胞，采用qRT⁃PCR 检测miR⁃16⁃5p 的表达，CCK8 实验检测细胞存活率，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western 印迹检测Cyclin D1、MMP2 和MMP9 的相对表达水平。

5.低表达lncRNA DLX6⁃AS1、敲减miR⁃16⁃5p后抑制NUCKS1 对A431 细胞的影响：取转染si⁃DLX6⁃AS1 和anti⁃miR⁃16⁃5p 后分别转染si⁃NUCKS1、NUCKS1⁃NC 的A431 细 胞，分 别 采 用CCK8 实验检测细胞存活率，Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力，Western 印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9的相对表达水平。

七、统计学处理

用SPSS21.0 软件对实验数据进行统计分析，所有数据均以±s 表示。两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、A431 与HaCaT 细胞中lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p、NUCKS1的表达

A431细胞中lncRNA DLX6⁃AS1的相对表达水平高于HaCaT 细胞（P<0.001），miR⁃16⁃5p 的相对表达水平低于HaCaT 细胞（P < 0.001），NUCKS1 mRNA 和蛋白的相对表达高于HaCaT 细胞（均P<0.001）。见图2、表2。

二、双荧光素酶报告系统验证lncRNA DLX6⁃AS1 与miR⁃16⁃5p、miR⁃16⁃5p 与NUCKS1 的靶向结合能力

共转染WT⁃DLX6⁃AS1后，miR⁃16⁃5p组细胞相对荧光素酶活性低于miR⁃NC 组（t = 14.87，P <0.05）；共转染WT⁃NUCKS1后，miR⁃16⁃5p组细胞相对荧光素酶活性亦低于miR⁃NC 组（t = 12.94，P <0.05）；而共转染MUT⁃DLX6⁃AS1、MUT⁃NUCKS1后，miR⁃16⁃5p组细胞相对荧光素酶活性与miR⁃NC组差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3。

三、低表达lncRNA DLX6⁃AS1 对A431 细胞的影响

si⁃DLX6⁃AS1 组细胞DLX6⁃AS1 表达水平（0.30 ± 0.03）低于DLX6⁃AS1⁃NC 组（1.00 ± 0.11，t = 18.42，P < 0.001），miR⁃16⁃5p 表达水平（3.01 ±0.31）高于DLX6⁃AS1⁃NC 组（1.02±0.10，t=18.33，P < 0.001），细胞存活率（55.13% ± 5.50%）低于DLX6⁃AS1⁃NC组（100.27%±10.05%，t=11.82，P<0.001）；si⁃DLX6⁃AS1 组细胞NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表达量均低于DLX6⁃AS1⁃NC组（均P<0.05，图4A、4B），细胞迁移和侵袭细胞数亦低于DLX6⁃AS1⁃NC组（均P<0.05，图4C、4D）。

四、高表达miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响

图2 Western 印迹检测HaCaT 和A431 细胞中NUCKS1 的表达 A431细胞中NUCKS1蛋白表达水平高于HaCaT细胞

表2 HaCaT和A431细胞中lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p和NUCKS1 mRNA及蛋白的表达比较（±s）

表2 HaCaT和A431细胞中lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p和NUCKS1 mRNA及蛋白的表达比较（±s）

注：n=9

组别HaCaT细胞A431细胞t值P值lncRNA DLX6⁃AS1 1.00±0.10 2.43±0.24 16.50<0.001 miR⁃16⁃5p 1.05±0.11 0.28±0.03 20.26<0.001 NUCKS1 mRNA 1.04±0.12 3.76±0.38 20.48<0.001 NUCKS1蛋白0.36±0.04 0.89±0.09 16.14<0.001

miR⁃16⁃5p 组A431 细胞miR⁃16⁃5p 表达水平（3.56 ± 0.36）高 于miR⁃NC 组（1.00 ± 0.12，t =20.24，P < 0.05），细胞存活率（65.73% ± 6.58%）低于miR⁃NC 组（100.27% ± 10.05%，t = 8.62，P <0.05）；miR⁃16⁃5p 组NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 表达水平均低于miR⁃NC 组（均P<0.05，图5A、5B），迁移和侵袭细胞数亦低于miR⁃NC 组（均P<0.05，图5C、5D）。

五、敲低NUCKS1对A431细胞的影响

si⁃NUCKS1组细胞存活率（54.03%±5.40%）低于NUCKS1⁃NC 组（100.10% ± 10.01%，t = 12.15，P < 0.05）；si⁃NUCKS1 组细胞中NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 表达水平均低于NUCKS1⁃NC组（均P<0.05，图6A、6B），迁移和侵袭细胞数亦低于NUCKS1⁃NC组（均P<0.05，图6C、6D）。

六、低表达lncRNA DLX6⁃AS1 后敲减miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响

共转染si⁃DLX6⁃AS1后，anti⁃miR⁃16⁃5p组miR⁃16⁃5p 表达水平（0.34 ± 0.04）低于anti⁃miR⁃NC 组（1.00 ± 0.12，t = 15.65，P < 0.05），细胞存活率（137.33%±13.75%）高于anti⁃miR⁃NC组（100.35%±10.05%，t = 6.51，P < 0.05），anti⁃miR⁃16⁃5p 组Cyclin D1、MMP2 和MMP9 相对表达水平均高于anti⁃miR⁃NC 组（均P < 0.05，图7A、7B），迁移和侵袭细胞数均高于anti⁃miR⁃NC 组（P < 0.05，图7C、7D）。

七、低表达lncRNA DLX6⁃AS1、敲减miR⁃16⁃5p后抑制NUCKS1表达对A431细胞的影响

低表达lncRNA DLX6⁃AS1、敲减miR⁃16⁃5p后，si⁃NUCKS1 组细胞存活率（73.86% ± 7.38%）低于NUCKS1⁃NC 组（137.33% ± 13.75%，t = 12.20，P <0.05）；si⁃NUCKS1 组NUCKS1、Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表达量均低于NUCKS1⁃NC 组（P <0.05，图8A、8B），迁移和侵袭细胞数均低于NUCKS1⁃NC组（P<0.05，图8C、8D）。

图3 双荧光素酶报告系统验证lncRNA DLX6⁃AS1与miR⁃16⁃5p（3A）及miR⁃16⁃5p与NUCKS1（3B）的靶向结合能力 a：miR⁃NC组与miR⁃16⁃5p组比较，P<0.05

图4 干扰lncRNA DLX6⁃AS1表达对A431细胞的影响 4A、4B：Western印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平的代表电泳图和统计图；4C、4D：Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的代表性细胞图和统计图。a：n=9，两组比较，P<0.05。lncRNA DLX6⁃AS1：长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；Cyclin D1：细胞周期蛋白D1；MMP：基质金属蛋白酶

图5 转染miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响 5A、5B：Western印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平的代表电泳图和统计图；5C、5D：Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的代表性细胞图和统计图。a：n=9，两组比较，P<0.05。NUCKS1：核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；Cyclin D1：细胞周期蛋白D1；MMP：基质金属蛋白酶

图6 敲低NUCKS1的表达对A431细胞的影响 6A、6B：Western印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对水平的代表电泳图和统计图；6C、6D：Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的代表性细胞图和统计图。a：n=9，两组比较，P<0.05。NUCKS1：核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；Cyclin D1：细胞周期蛋白D1；MMP：基质金属蛋白酶

图7 低表达lncRNA DLX6⁃AS1后敲减miR⁃16⁃5p对A431细胞的影响 7A、7B：Western印迹检测Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白表达水平的代表电泳图和统计图；7C、7D：Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的代表性细胞图和统计图。a：n=9，两组比较，P<0.05。lncRNA DLX6⁃AS1：长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；Cyclin D1：细胞周期蛋白D1；MMP：基质金属蛋白酶

图8 低表达lncRNA DLX6⁃AS1、敲减miR⁃16⁃5p 后抑制NUCKS1 表达对A431 的影响 8A、8B：Western 印迹检测NUCKS1、Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白相对表达水平的代表电泳图和统计图；8C、8D：Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的代表性细胞图和统计图。a：n=9，两组比较，P<0.05。lncRNA DLX6⁃AS1：长链非编码生长停滞特异性蛋白6反义RNA1；NUCKS1：核酪蛋白激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶底物1；Cyclin D1：细胞周期蛋白D1；MMP：基质金属蛋白酶

讨 论

以往研究显示，lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p、NUCKS1 在多种癌症中异常表达，可参与癌症的发生、发展，然而其对皮肤鳞癌的影响还不清楚。本研究检测lncRNA DLX6⁃AS1、miR⁃16⁃5p 和NUCKS1 在HaCaT 与A431 细胞中的表达水平，结果显示，lncRNA DLX6⁃AS1、NUCKS1 在A431 细胞中表达上调，而miR⁃16⁃5p下调表达，提示其可能具有相关性。为研究它们之间是否具有相互作用关系，我们通过starBase 预测发现，miR⁃16⁃5p 与lncRNA DLX6⁃AS1以及NUCKS1均有结合位点，推测lncRNA DLX6⁃AS1 可能靶向调控miR⁃16⁃5p，而miR⁃16⁃5p 可能靶向调控NUCKS1，进一步通过双荧光素酶报告实验进行验证，证实了starBase 预测的结合关系。

为进一步研究lncRNA DLX6⁃AS1 对鳞癌细胞生物学行为的影响，我们干扰lncRNA DLX6⁃AS1表达，发现Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表达水平降低，细胞增殖及迁移和侵袭活性降低。Cyclin D1 是细胞周期正调控相关蛋白，其表达水平与细胞增殖呈正相关［11］；MMP2 和MMP9 是细胞迁移、侵袭相关蛋白，其表达水平与细胞迁移、侵袭呈正相关［12］。结果提示，低表达lncRNA DLX6⁃AS1 可抑制皮肤鳞癌增殖和转移。既往文献报道在食管鳞癌中lncRNA DLX6⁃AS1 表达上调，敲除lncRNA DLX6⁃AS1可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡［13］。本实验结果与既往研究结果相符。

已有研究证实，miR⁃16⁃5p 在脊索瘤［14］、乳腺癌［15］、肝癌［16］等恶性肿瘤中均表达下调，且调控癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究通过调控miR⁃16⁃5p 的表达探讨其对皮肤鳞癌细胞的影响，过表达miR⁃16⁃5p 后Cyclin D1、MMP2 和MMP9 蛋白表达水平降低，细胞增殖及迁移和侵袭活性降低，提示过表达miR⁃16⁃5p可抑制A431细胞增殖、迁移和侵袭。本研究表明，lncRNA DLX6⁃AS1 靶向调控miR⁃16⁃5p，而敲减miR⁃16⁃5p 的同时低表达lncRNA DLX6⁃AS1，Cyclin D1、MMP2和MMP9蛋白表达水平升高，细胞增殖及迁移和侵袭活性升高，说明敲减miR⁃16⁃5p 逆转了低表达lncRNA DLX6⁃AS1对A431细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步表明lncRNA DLX6⁃AS1 可能通过靶向负调控miR⁃16⁃5p影响A431细胞增殖、迁移和侵袭。

另外，本研究发现，NUCKS1在A431细胞中高表达，与肝细胞癌［17］、宫颈鳞癌［18］中的表达趋势相同。为研究NUCKS1 对A431 细胞的影响，我们抑制NUCKS1的表达，发现A431细胞的增殖、迁移和侵袭亦受到抑制，说明NUCKS1在皮肤鳞癌细胞的增殖和转移中具有重要作用。进一步实验发现，低表达NUCKS1 可部分逆转敲减miR⁃16⁃5p 和lncRNA DLX6⁃AS1 低表达对A431 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，根据以上结果，推测在皮肤鳞癌中lncRNA DLX6⁃AS1通过调控miR⁃16⁃5p/NUCKS1发挥致癌作用。

综上，本研究表明，低表达lncRNA DLX6⁃AS1可通过靶向上调miR⁃16⁃5p进而下调NUCKS1的表达，抑制A431细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究的不足之处为只针对皮肤鳞癌细胞A431进行了体外研究，未进行相应的动物实验，后续将进行相应的动物体内实验，为皮肤鳞癌的临床研究提供更多的数据支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突