特应性皮炎患者面部、上肢和背部皮损真菌群落多样性分析

陆茂 冉玉平 代亚玲 欧美 吴红梅 罗媛元

1四川大学华西医院皮肤科，成都610041；2成都医学院第一附属医院皮肤科610500陆茂现在成都医学院第一附属医院皮肤科，成都610500

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种临床常见的慢性、复发性、瘙痒性、炎症性皮肤病。近年来微生物定植（包括细菌、真菌等）在AD 发病中的作用逐渐得到重视，但既往对微生物的研究仅集中在其中少数几种，多采用分离培养法来确定微生物与AD 的关系，未从宏观上兼顾微生物协作共生的角度分析，缺乏对微生物群落整体分布和结构的研究。目前对AD患者皮肤微生物多样性研究主要集中于细菌群落［1⁃3］，而对皮肤真菌群落多样性研究的报道很少。我们在AD 患者面部、上肢和背部皮损区和健康人相应区域采样，提取样品DNA，应用真菌通用引物内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS2 进行PCR 扩增，通过MiSeq 高通量测序及生物信息学研究，分析AD 患者皮肤真菌群落多样性及其与临床特征的相关性。

对象与方法

一、对象

10 例入选的AD 患者来自2015 年9- 10 月成都医学院第一附属医院皮肤科门诊，符合AD 的诊断标准［4］，且每例患者皮损均累及面部、上肢和背部。男5 例，女5 例；年龄2～12（7.30 ± 3.89）岁。10例健康对照来自成都医学院第一附属医院工作人员子女，男6例，女4例；年龄3～14（6.90±3.54）岁。受试者2周内无使用抗真菌药物和糖皮质激素史，采样前24 h内不能在采样部位使用任何清洁用品（包括水洗）或药物，不伴有其他皮肤病，不伴有肿瘤或其他严重疾患。对AD 患者病情严重程度进行评分，参照湿疹面积及严重度指数（eczema area and severity index，EASI）评分法［5］，<7 分为轻度，7～21 分为中度，> 21 分为重度［6］，10 例AD 患者EASI评分为（16.51±14.71）分（范围3.0～55.2 分），其中轻度3 例，中度4 例，重度3例。本研究通过成都医学院第一附属医院伦理委员会批准（批件号2018CYFYHEC⁃BA⁃40），所有受试者的监护人均签署知情同意书，对有能力做出同意参加临床试验决定的儿童，还征得其本人同意。

二、方法

1.主要试剂和仪器：医用无菌棉签（成都市新津事丰医疗器械有限公司），E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（美国Omega Bio⁃Tek 公司），ITS1、ITS2 引物（上海美吉生物医药科技有限公司），ABI GeneAmp®9700型PCR 仪（美国Thermo 公司），QuantiFluor™⁃ST 蓝色荧光定量系统（美国Promega 公司），FR⁃200A 凝胶成像系统（上海复日科技有限公司），Nanodrop 3300荧光分光光度计（美国Thermo公司），Miseq测序仪（美国Illumina公司）。

2.采样：采样部位为AD患者面部、上肢和背部皮损区以及健康对照的相应区域，AD 患者皮损区为慢性或消退期无渗出皮损。采样时室温26 ℃左右。采样方法：在采样部位选取一处约3 cm×3 cm区域；将医用无菌棉签在生理氯化钠溶液中润湿，在选定区域内来回涂擦50 次，持续时间约45 s；用无菌镊子取下棉签头并放置在1.5 ml 无菌EP 管中，-80 ℃保存。健康对照样本按面部、上肢、背部顺序依次编为1～30 号，AD 患者依次编为31～60号。

3.样本DNA 的提取、PCR 扩增及MiSeq 测序：所有样本送上海美吉生物医药科技有限公司采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit 提取皮肤样本DNA。利用ITS1引物（5′⁃CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA⁃3′）、ITS2引物（5′⁃GCTGCGTTCTTCATCGATGC⁃3′）进行PCR 扩增。扩增体系为20 μl，包括10 × 缓冲液2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 2 μl、5 μmol/L 上游和下游引物各0.8 μl、rTaq聚合酶0.2 μl、DNA模板2 μl，牛血清白蛋白0.2 μl，补ddH2O 至20 μl。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。利用Illumina MiSeq 技术测序平台，完成扩增子测序。

4.生物信息分析：对原始数据进行质控过滤，得到优化序列。然后在去除嵌合体序列后进行序列可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）的划分聚类分析，并对OTU 的代表序列作分类学分析。基于OTU 聚类分析结果进行多样性指数分析、主成分分析，基于OTU 分类学信息结果进行物种组成分析。采用Shannon 指数计算微生物群落多样性，其数值越大说明群落多样性越高。

5.统计学方法：应用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料采用±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，两两组间多重比较采用LSD⁃t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、测序结果

原始测序数据为1 773 637×2条reads，经质控过滤后得到2 652 101 条优化（有效）序列，平均长度242.77 bp。所有序列经过聚类，60 个样本共得到4 312 个有效OTU。其中10 例AD 患者的30 份标本有3 357个有效OTU，10例健康对照的30份标本有2 956个有效OTU，两者共有2 001个相同的有效OTU。

二、多样性指数分析

AD 患者组总样本和面部、上肢、背部样本Shannon 指数均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05 或0.01），见表1。AD 患者组3 个部位Shannon 指数比较差异无统计学意义（F=0.51，P > 0.05），健康对照组差异也无统计学意义（F =0.42，P>0.05）。

三、物种组成分析

1.总样本真菌群落结构分析：所有样本中超过99%的真菌来自担子菌门（58.50%）和子囊菌门（40.92%）。其中担子菌门的马拉色菌属在各样本中均占主要地位，在AD 患者组总样本中丰度为42.59%，健康对照组为49.34%，两组高于0.1%的属均为88 个，除马拉色菌属外其他属的丰度都<10%，丰度>1%的主要真菌属见表2。AD患者组念珠菌属、曲霉属丰度高于健康对照组，差异均有统计学意义（t 值分别为3.515、2.137，均P<0.05），其余各主要真菌属丰度比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

2. 不同部位真菌属构成分析：见图1，两组马拉色菌属均占主要地位（丰度近50%）。AD 患者组、健康对照组面部皮肤丰度高于0.1%的属分别有87 个、82 个，上肢均为86 个，背部分别为85 个、86 个，丰度> 1%的主要真菌属见表3。两组面部各主要真菌属（丰度>1%）丰度差异均无统计学意义（均P>0.05）；AD患者组上肢念珠菌属丰度高于健康对照组（t=3.186，P<0.05），其余各主要真菌属丰度差异均无统计学意义（均P>0.05）。AD 患者组背部曲霉属丰度高于健康对照组（t = 2.736，P<0.05），其余各主要真菌属丰度差异均无统计学意义（均P>0.05）。两组面部、上肢和背部样本之间主要真菌属（丰度>1%）丰度差异均无统计学意义（P>0.05）。

表1 特应性皮炎患者组与健康对照组皮肤样本真菌Shannon指数比较（±s）

表1 特应性皮炎患者组与健康对照组皮肤样本真菌Shannon指数比较（±s）

组别患者组健康对照组t值P值例数10 10总样本4.04±2.80 3.21±0.99 4.45<0.01面部4.11±0.28 3.42±0.77 2.67 0.02上肢3.98±0.34 3.04±1.14 2.37 0.04背部4.05±0.19 3.14±0.84 3.34 0.01

表2 特应性皮炎患者组和健康对照组皮肤样本总样本丰度>1%的真菌属

3.AD 患者样本真菌属构成分析：轻、中、重度AD 患者组均以马拉色菌属占主要地位（近50%），见图2。轻、中、重度AD患者组丰度高于0.1%的属分别有81、82 和84 个，丰度>1%的主要真菌属见表4。轻、中、重度AD患者组各主要真菌属丰度差异均无统计学意义（均P>0.05）。

图1 特应性皮炎（AD）患者和健康对照面部、上肢和背部皮肤样本真菌群落结构柱形图

图2 轻中重度特应性皮炎（AD）患者皮肤样本真菌群落结构柱形图

4.马拉色菌属结构分析：AD患者组共有（5.37±1.94）个马拉色菌菌种，健康对照组（4.10±1.42）个，两组差异有统计学意义（t=2.885，P<0.05）。

AD患者组与健康对照组马拉色菌菌种构成见表5，球形马拉色菌、限制马拉色菌丰度较高，两者合计约为80%。球形马拉色菌在AD患者组样本中占41.19% ± 34.17%，在健康对照组中占35.70% ±29.42%，两组差异无统计学意义（t = 0.828，P >0.05）；限制马拉色菌在AD 患者组占40.07% ±28.71%，在健康对照组占42.07%±36.54%，两组差异亦无统计学意义（t=-0.409，P>0.05）；其余各马拉色菌菌种在两组间差异均无统计学意义（P >0.05）。

表3 特应性皮炎（AD）患者和健康对照面部、上肢和背部皮肤样本主要真菌属（丰度>1%）

5.念珠菌属结构分析：AD 患者组共有（5.77±3.01）个念珠菌菌种，健康对照组有（4.90 ± 2.09）个，两组差异无统计学意义（t = 1.294，P > 0.05）。两组念珠菌菌种构成见表6，近平滑念珠菌丰度较高，占比均>75%。各念珠菌菌种在两组间的比例差异均无统计学意义（P>0.05）。

表4 轻中重度特应性皮炎患者皮肤样本主要真菌属（丰度>1%）

表5 特应性皮炎患者与健康对照皮肤马拉色菌菌种构成

四、AD 患者组各部位皮肤真菌群落主成分分析

见图3，AD患者组面部、上肢、背部皮肤真菌群落未按病情严重程度聚类。

讨 论

早期的皮肤微生物多样性研究主要采用分离培养来识别微生物群落的结构特征，而大量微生物因生长条件苛刻不能或不易分离培养［7］，因此难以全面认识皮肤微生物的多样性和群落结构。随着测序技术的发展，在皮肤原位取样进行高通量测序，在分子水平基于序列分析成为研究皮肤微生物群落多样性和结构特征的主流方法［8］。不少研究者使用此方法研究皮肤细菌的群落特征，但针对皮肤真菌的研究则很少。2013年，美国学者［9］首次报道用高通量测序技术研究健康人皮肤真菌群落多样性的方法和结果，即使用棉签收集10例18～40岁健康人14个部位的皮肤样本，利用ABI3730xl和罗氏454 测序平台，对样本中的ITS1 区进行测序分析。结果显示，样本中真菌均来自担子菌门和子囊菌门，担子菌门的马拉色菌属在除足部的其他11个部位占主要地位，其真菌群落多样性主要表现在马拉色菌各个菌种的分布，其中外耳道、耳后和眉间以限制马拉色菌为主，中上背、枕部和腹股沟以球形马拉色菌为主，鼻孔、肘窝、前臂屈侧和小鱼际以球形马拉色菌、限制马拉色菌和合轴马拉色菌为主，而足部的3个部位真菌群落多样性非常高，约有80种真菌。Zhang 等［10］采用高通量测序技术研究9 例AD 患者面部皮损和10 例健康对照相同区域的真菌群落多样性，结果显示：①AD患者组中马拉色菌属占主要地位（68.7%），非马拉色菌酵母菌占19.9%，霉菌占12.3%，健康对照组中马拉色菌属也占主要地位（79.2%），非马拉色菌酵母菌占12.8%，霉菌占8.1%；②球形马拉色菌和限制马拉色菌是AD 患者组和健康对照组的主要菌种；③共检测到15个非马拉色菌酵母菌属，排在前3位的是念珠菌属、枝孢属和隐球菌属，AD患者非马拉色菌酵母菌菌种多样性显著高于健康对照；④共检测到16 个霉菌属，排在前3 位的是链格孢属、Apioplagiostoma和曲霉属，AD 患者霉菌菌种多样性与健康对照无显著差异。

表6 特应性皮炎患者与健康对照皮肤样本念珠菌菌种构成

图3 轻中重度特应性皮炎患者皮肤样本真菌群落主成分分析图 3A：面部；3B：上肢；3C：背部

本研究中AD患者组和健康对照组各部位皮肤真菌物种分布以担子菌门的马拉色菌占主要地位，总体丰度约占50%，而美国健康人皮肤真菌多样性研究结果显示，相同部位马拉色菌的相对丰度接近100%［9］，日本研究结果显示，AD患者面部皮损马拉色菌的相对丰度为68.7%，健康对照为79.2%［10］。国内报道显示，健康青年女性面部马拉色菌的相对丰度为48.2%［11］，这提示人种和地区可能是影响皮肤马拉色菌定植的两个重要因素。除马拉色菌属外，AD 患者和健康对照面部、上肢、背部丰度相对较高的主要真菌属还有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、枝孢属、毛孢子菌属、链格孢属、镰刀菌属等，与国内外研究结果类似［9⁃11］。本研究主成分分析显示，AD 患者面部、上肢、背部皮损真菌群落未按病情严重程度聚类，提示其真菌群落组成与疾病严重程度无相关性。微生物导致AD发病多是作为变应原进入体内引起相关免疫反应所致，其病情严重程度与进入体内引起免疫反应微生物的种类和数量有关，由于AD患者多有皮肤屏障功能障碍［12］，可影响微生物进入体内难易程度，而且皮损的性质、局部免疫反应也可能对微生物入侵有影响，推测患者的病情严重程度不仅与皮肤表面微生物的定植情况有关，还可能受多种与微生物入侵相关因素的影响，因此从理论上来说AD 患者皮肤表面真菌群落分布不一定与疾病严重程度有相关性。不过考虑到本研究病例数太少，上述结论仍需进行更多病例的验证。

本研究多样性指数分析显示，AD患者面部、上肢、背部皮损区真菌群落多样性明显高于健康对照相应区域。皮肤与其表面定居的大量微生物构成皮肤微生态系统，微生物与微生物之间、微生物与宿主之间紧密联系、相互影响，皮肤生理状态的改变可引起微生物群落结构和多样性的变化，推测AD患者真菌群落多样性高于健康对照可能的原因包括：①AD 患者皮肤生理状态的异常主要表现为屏障功能障碍，包括角质层含水量、皮肤表面pH值、皮脂含量等异常［13⁃15］，既往研究表明这些指标的异常与真菌的异常定植或感染有关［16⁃18］；②AD患者皮肤聚丝蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）、内披蛋白（IVL）等角化包膜成分表达减少甚至缺乏［19⁃20］，而FLG、LOR和IVL表达下降与真菌感染有关［21］；③AD患者皮肤抗菌肽表达下降，也有利于真菌的定植和感染［22］；④AD 患者普遍存在Th1/Th2细胞因子失衡，白细胞介素（IL）⁃4、IL⁃6、IL⁃13等水平明显升高［23］，IL⁃4、IL⁃13 可抑制AD 患者皮肤角质形成细胞FLG、LOR、IVL 及人β 防御素2 的表达［24⁃27］，IL⁃4、IL⁃6 可下调AD 患者角质层细胞神经酰胺的表达［28］，而神经酰胺、人β 防御素2 参与皮肤的固有免疫，防御真菌等病原体的入侵［29⁃30］。总之，皮肤物理屏障功能障碍、皮肤表面抗菌肽表达异常、Th1/Th2 细胞因子失衡均有利于真菌的定植和感染，可能是导致AD 患者面部、上肢、背部皮损区真菌群落多样性明显高于健康对照相应区域的原因。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突