杨桃种质果实品质性状遗传多样性分析

马小卫，苏穆清，李栋梁，郑 斌，邹明宏,*

（1.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，海南省热带作物营养重点实验室，广东 湛江 524091；2.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048）

杨桃（Averrhoa carambolaL.）又名阳桃、三稔子、洋桃等，属酢浆草科（Oxalidaceae）五敛子属，多年生常绿木本果树。因杨桃果实横切面呈星型，又称之为“星梨”，其成熟果实味甜、多汁、微酸，具有令人愉悦的香气，同时具有药用和食疗价值[1-3]，是深受消费者喜爱的时令水果。杨桃原产于东南亚热带和亚热带地区，中国种植杨桃已有2 000多年的历史，目前主要分布在广东、广西、福建、云南和台湾等地[4]。在长期栽培中，由于各种植区气候和土壤等环境条件的不同，形成了具有丰富遗传多样性的种质资源。在已有杨桃种质资源的研究中，主要是利用各种分子标记分析杨桃种质的遗传多样性[5-6]，其他文献中，如刘胜辉等[7]研究了3 个杨桃品种果实香气组成，朱银玲[8]分析了杨桃叶中6 种矿质元素含量，戴子云[9]评价了19 个杨桃品种铬的富集能力，而从种质资源角度综合评价杨桃果实品质性状的研究鲜见报道。针对此问题，本研究从形态、化学、营养等方面鉴定和评价杨桃种质果实品质性状多样性，为客观评价及利用种质资源培育新品种，满足市场需求提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

21 份供试种质资源来源于中国热带农业科学院南亚热带作物种质资源圃（位于广东省湛江市麻章区）。2018年9—11月，在各种质成熟期，每份种质采集15～20 个成熟果实。不同种质成熟期的确定是根据果皮的色泽和果实风味变化，并结合往年的数据记录。

乙腈、乙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、酒石酸、苹果酸、VC、柠檬酸（均为色谱纯） 西格玛奥德里奇（上海）有限公司；偏磷酸、硫酸、浓硝酸、高氯酸（均为分析纯） 广东西陇科学股份有限公司；NaOH（分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ICP电感耦合等离子体发射光谱仪 日本岛津公司；1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

果实采摘后分为三部分，一部分用于果实单果质量、纵径、横径以及可溶性固形物和可滴定酸含量分析；另一部分液氮速冻后置于-70 ℃冰箱保存，用于可溶性糖和酸含量分析；其余部分置70 ℃烘箱中烘干，用于矿质元素分析。

1.3.2 果实可溶性固形物和可滴定酸含量测定

可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）用手持折光仪测定，可滴定酸（titratable acid，TA）含量采用NaOH滴定法测定。

1.3.3 果实可溶性糖和有机酸含量测定

利用高效液相色谱法分析果实可溶性糖（果糖、葡萄糖和蔗糖）和有机酸（VC、酒石酸、苹果酸和柠檬酸）含量[10]。

可溶性糖含量测定：取1.0 g果肉加入5 mL、体积分数85%乙醇溶液研磨成匀浆后，于40 ℃水浴提取20 min后，室温下10 000 r/min离心10 min，85 ℃水浴蒸干。用4 mL蒸馏水溶解，取1 mL过0.4 μm滤膜用于高效液相色谱分析。RI-1530示差检测器，流速1.0 mL/min，柱温27 ℃，进样量10 μL，测定时间为15 min。

有机酸含量测定：取果肉样品1.0 g，用5 mL偏磷酸（2 g/L）冰浴研磨，10 000×g离心15 min，取上清液；沉淀经4 mL偏磷酸充分洗涤后离心，取上清液；合并上清液，偏磷酸定容至10 mL。混匀后，取1 mL样品，经0.45 μm滤膜过滤后待测。紫外检测器测定，色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm），流动相为偏磷酸（0.2 g/L），流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测时间为30 min。

果实总糖含量为所测各可溶性糖含量之和，总酸含量为所测各有机酸含量之和。果实甜度值参照马小卫等[11]的方法计算，如下式所示。

甜度值＝蔗糖含量/（mg/g）×1.00+果糖含量/（mg/g）×1.75+葡萄糖含量/（mg/g）×0.75

1.3.4 果实矿质元素含量测定

矿质元素含量测定参照鲍士旦[12]的方法，以硫酸消煮-火焰光度法测定钾含量，以浓硝酸、高氯酸（4∶1，V/V）消煮-ICP电感耦合等离子体发射光谱仪测定钙、镁、铜、铁、锰和锌含量。

1.4 数据处理与分析

采用SAS 11.0软件对数据进行单因素方差分析，相关性分析和主成分分析利用XLstat软件。进行主成分分析（principal component analysis，PCA）前，参考马庆华等[13]的方法利用隶属度函数法对原始数据进行标准化，并计算各品种的综合得分。

2 结果与分析

2.1 果实外观表型结果

图 1 21 份杨桃种质资源果实照片Fig. 1 Photographs of 21 carambola germplasm accessions

供试种质的外观形状如图1所示，可以看出不同杨桃种质间外观色泽及形状变化幅度较小，所有种质均为五角形状。21 份杨桃果实的纵径、横径及果形指数（纵径/横径）平均值分别为101.87、65.59 mm和1.56，变异系数分别为9.97%、10.63%和10.89%（表1）。果实纵径最长的是‘新加坡黄肉’（123.05 mm），最短的为‘马来西亚红’（80.59 mm）；果实横径最长的为‘台农3号’（83.87 mm），最短的为‘马来西亚红’（56.07 mm）。果形指数较大的是‘广西3号’（1.95）和‘马来西亚红’（1.83），这些果实为长果型，果长是果宽的约2 倍；而‘台农号’和‘台农4号’果形指数最小，分别为1.30和1.26。

表 1 21 份杨桃种质资源果实表型特征多样性分析Table 1 Diversity analysis of fruit phenotypic characters in 21 carambola germplasm accessions

21 份杨桃种质单果质量平均值为109.98 g，范围在71.46～173.52 g，变异系数为19.33%。其中单果质量较大的种质有‘化州红’（173.52 g）、‘广西4号’（135.17 g）和‘广西2号’（129.49 g），单果质量较小的种质是‘台湾秤锤’（86.15 g）、‘台农3号’（79.55 g）和‘台农1号’（71.46 g）。2.2 果实可滴定酸和可溶性固形物含量

表 2 21 份杨桃种质资源果实SSC和TA含量多样性分析Table 2 Diversity analysis of SSC and TA content in 21 carambola germplasm accessions

由表2可知，21 份杨桃种质SSC和TA含量的变化范围分别是5.90～8.10 °Brix和0.28～1.92 mmol/100 g，平均值分别为7.12 °Brix和0.56 mmol/100 g，变异系数分别为7.44%和58.47%。相对于TA含量，种质间SSC的变化幅度较小。‘台农1号’、‘广西2号’、‘新加坡红肉’果实SSC较高，分别为8.1、7.6 °Brix和7.6 °Brix，而‘台农2号’和‘马来西亚B10’果实SSC较低，分别为6.5 °Brix和5.9 °Brix。在所分析种质中，‘广西4号’TA含量（1.92 mmol/100 g）明显高于其他种质。大部分种质TA含量为0.41～0.67 mmol/100 g，占所有种质的76.19%；而‘台湾秤锤’、‘马来西亚B10’、‘新加坡红肉’和‘台农1号’TA含量较低。不同种质间固酸比（SSC/TA）变化幅度较小，范围在3.70～28.57，平均值14.75，变异系数为36.94%。其中固酸比较高的种质是‘台湾秤锤’（20.28）、‘新加坡红肉’（25.60）和‘台农1号’（28.57），大部分种质固酸比集中在10.50～19.00，约占所有种质的80.95%；‘广西4号’固酸比最小（3.70），明显低于其他种质，这和其TA含量较高有关。

2.3 果实可溶性糖和有机酸含量

表 3 21 份杨桃种质资源果实可溶性糖和有机酸性状多样性分析Table 3 Diversity analysis of sugars and organic acids in 21 carambola germplasm accessions

由表3可知，不同杨桃种质间总糖含量差异明显，总糖含量变化范围在39.82（‘台农2号’）～61.20 mg/g（‘马来西亚’）之间，平均值为53.22 mg/g，变异系数为10.86%。甜度值与总糖变化趋势很相似，甜度值变化范围在48.39～74.22，平均值为64.64。甜度值最高的3 个种质为‘马来西亚’、‘台农1号’和‘台农4号’，而‘广西1号’、‘大世纪’和‘台农2号’甜度值较低。杨桃果实中可溶性糖以葡萄糖和果糖为主，分别占总糖的44%和47%，蔗糖含量很低，占总糖的0.08%。21 份种质葡萄糖含量在19.63（‘台农2号’）～29.18 mg/g（‘马来西亚’）之间，平均值为25.16 mg/g，变异系数分别为10.29%。‘台湾3号’的果糖含量最高（27.18 mg/g），‘台农2号’果糖含量最低（17.96 mg/g），平均值为23.62 mg/g，果糖含量变异系数为11.01%；杨桃果实蔗糖含量为0.70（‘广西4号’）～8.54 mg/g（‘新加坡红肉’），平均值为4.43 mg/g。

杨桃果实总酸含量变化范围在0.93～3.76 mg/g，平均值为2.61 mg/g，变异系数为73.54%。在所分析种质中，‘广西4号’总酸含量明显高于其他品种，而‘台农2号’、‘大世纪’和‘马来西亚红’总酸含量较低。杨桃果实有机酸以酒石酸含量最高，平均值是1.80 mg/g，占总酸的68.97%；其次是苹果酸，其含量和所占总酸比例分别是0.49 mg/g和18.77%，其中‘广西1号’、‘台农1号’、‘大世纪’和‘马来西亚红’果实中苹果酸含量高于酒石酸。苹果酸酸味柔和、爽快，与柠檬酸相比刺激性缓慢，保留时间长，因此苹果酸优势型种质应作为杨桃种质中的优势种质；再次是VC，占总酸的7.28%；含量最低的是柠檬酸，所占总酸比例为5.36%。

2 1 份杨桃种质的酒石酸含量变化范围在0.15～9.03 mg/g，变异系数为109.95%，变化幅度较大；‘广西4号’酒石酸含量最高（9.03 mg/g），其次是‘台农4号’、‘新加坡红肉’和‘马来西亚’，平均含量2.87 mg/g，含量最低的3 份种质是‘马来西亚红’、‘实生酸’和‘台湾软枝’，平均含量0.19 mg/g。所测定种质中苹果酸含量最低值是0.11 mg/g，最高值0.80 mg/g（‘台农1号’）是最低值的7.27 倍，大部分种质含量集中在0.40～0.74 mg/g，占所有种质的71.4%；‘广西4号’和‘台农2号’含量较低。不同杨桃种质VC含量变化幅度较小（32.40%），范围在0.09～0.35 mg/g；其中含量较高的种质是‘广西4号’（0.35 mg/g）、‘台农3号’（0.32 mg/g）和‘实生酸’（0.25 mg/g）；其余品种的含量集中在0.09～0.22 mg/g，‘新加坡黄肉’和‘马来西亚B10’含量较低。柠檬酸含量较低，在0.02～0.50 mg/g之间，平均值为0.14 mg/g，变异系数79.07%，变化幅度较大；含量较低的种质是‘香蜜’、‘马来西亚香蜜’、‘马来西亚’和‘新加坡红肉’，含量最高的种质是‘台农1号’（0.50 mg/g）。柠檬酸酸味较强，常作为添加剂用于食品工业。柠檬酸含量较高的杨桃种质也应作为重要资源加以利用，以培育风味多样化的品种。

以各种质的总可溶性糖含量（果糖、葡萄糖和蔗糖含量之和）与总有机酸含量（酒石酸、苹果酸、柠檬酸和VC含量之和）进行比值计算，21 份杨桃种质糖酸比范围在6.01～55.53，平均值29.05，变异系数为54.97%。‘马来西亚红’、‘大世纪’、‘台农2号’、‘广西1号’、‘台湾软枝’、‘实生酸’、‘马来西亚B10’、‘广西3号’、‘台湾秤锤’和‘台农1号’果实糖酸比较高，平均值44.03；‘广西4号’糖酸比最低（6.01），其余种质糖酸比范围在11.21～24.89，平均值16.38。

2.4 果实矿质元素含量

表 4 21 份杨桃种质资源果实矿质元素含量多样性分析Table 4 Diversity analysis of minerals content in 21 carambola germplasm accessions

7 种矿质元素在21 份杨桃种质中的含量范围、平均值、标准差、变异系数见表4。钾、钙和镁是杨桃果实的主要矿质元素，平均含量分别为1.46 g/100 g、638.82 mg/kg和837.39 mg/kg；大、中量元素钾、钙和镁的含量明显高于另外4 种微量元素。在所有种质中，除‘化州红’果实钙含量高于镁外，其余种质3 种元素含量排序为钾＞镁＞钙。杨桃果实铁、锰、锌和铜含量较低，平均含量分别为152.73、89.99、27.41 mg/kg和5.12 mg/kg。在所分析样品中，‘马来西亚香蜜’、‘化州红’、‘广西2号’和‘新加坡黄肉’果实锰含量高于铁含量，其余各种质果实4 种微量元素的含量排序为铁＞锰＞锌＞铜，占所有品种的80.95%。

铁的变异系数（104.78%）明显高于其他3 种微量元素（铜、锌、锰），表明不同杨桃种质间Fe含量差异较大，其中‘广西1号’（725.04 mg/kg）和‘化州红’（492.23 mg/kg）铁含量远高于其他种质，这些资源可以看成是杨桃种质中的宝贵资源，作为富Fe育种的材料；‘马来西亚B10’、‘马来西亚香蜜’、‘马来西亚’、‘台湾金星’、‘台农4号’、‘香蜜’和‘台农2号’7 份种质铁含量范围在114.96～185.83 mg/kg，平均值146.16 mg/kg，占所有种质的33.33%；其他11 份种质Fe含量范围在66.95～93.12 mg/kg，平均值80.27 mg/kg。

2.5 基于果实性状的聚类分析和相关性分析结果

相关性分析结果表明（表5），杨桃果实各性状之间存在复杂的正负相关性。SSC与固酸比、果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量、总糖含量及甜度值之间存在极显著的正相关关系；锌含量与钾、铜含量之间，锰含量与钙、铜含量之间也存在显著或极显著的正相关关系；蔗糖含量与锰、钙、铜含量及可滴定酸含量之间具有显著或极显著负相关关系，而与SSC和固酸比之间呈极显著正相关；酒石酸含量与苹果酸含量、糖酸比之间呈极显著负相关，与VC、总酸含量分别呈显著和极显著正相关。

图 2 25 项品质指标聚类图Fig. 2 Dendrogram obtained from cluster analysis of 25 measured traits

表 5 果实品质性状相关性分析Table 5 Correlation analysis of fruit quality traits

利用切比雪夫距离，采用Ward方法对25 项果实表型指标进行聚类分析，由图2可知，25 项指标可以分为6 个组。第一组性状包括VC、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、可滴定酸、总酸、钾、铜含量和果形指数、SSC、蔗糖含量，主要反映了果实酸度；第二组性状包括总糖含量、甜度值、果糖含量、葡萄糖含量、固酸比、糖酸比和果实横径，反映了果实含糖量；第三组性状包括单果质量、果实纵径和锰含量，反映了果实大小；第四组、第五组和第六组均包含1 个性状，分别是钙含量、镁含量和铁含量。果实性状的聚类结果与各性状之间的相关性分析结果一致，相关性分析和聚类分析结果可为今后开展杨桃种质资源综合性状评价时观测性状的取舍提供参考依据。

2.6 基于果实性状的主成分分析

PCA法被用于评价各参数对果实品质变异的贡献。对所测的杨桃果实25 个指标原始数据经隶属函数转化后进行PCA（表6），前两个主成分累积贡献率为42.13%，前6 个主成分累积方差贡献率达到81.63%，说明这6 个主成分可以基本反映全部指标的信息，但同时也可以看出各性状的贡献率分散，累积贡献率增长不明显，说明性状变异的多向性。

表 6 各性状主成分的特征向量及贡献率Table 6 Eigenvectors and percentages of cumulative contribution of principal components

图 3 杨桃种质第1、2主成分得分与果实性状载荷的双标图Fig. 3 Biplot of factor scores and loadings based on 1st and 2nd principal components

如表6和图3所示，第一主成分（PC1）贡献率为25.18%，特征向量绝对值较大的是SSC、固酸比、总糖含量和甜度值，其特性向量值均在0.60以上，主要反映了果实的含糖量。PC1较高的正值表明杨桃果实甜度值、SSC、固酸比和总糖含量之和高，代表种质有‘马来西亚红’、‘台农1号’、‘广西3号’和‘台湾软枝’；PC1较低的负值表明杨桃果实纵径和果实横径大，代表种质有‘台农4号’、‘香蜜’和‘马来西亚B10’。第二主成分（PC2）贡献率为16.95%，特征向量绝对值较大的是钙、铜、锰、葡萄糖、果糖、蔗糖、酒石酸、总酸含量和糖酸比，其特性向量值均在0.47以上；PC2较高的正值表明杨桃果实钙、铜、锰、葡萄糖和果糖含量高，代表种质有‘马来西亚香蜜’和‘化州红’；PC2较低的负值表明杨桃果实蔗糖含量和糖酸比高，代表种质有‘台农2号’、‘广西1号’、‘大世纪’和‘实生酸’。主成分不同方向的增长结果为杨桃特异种质筛选和优良种质选育提供了理论参考。

图3比较直观反映了各种质在前两个主成分中的分布情况。为综合评价各种质的果实品质，以主成分贡献率为权重，计算各种质前6 个主成分的分值与相应权重乘积的之和，得到各种质的综合得分（表7），各种质综合得分（Y综合）＝F1×25.177+F2×16.950+F3×14.501+F4×10.145+F5×8.255+F6×6.605。依据各种质的综合评价得分，21 份杨桃种质果实品质的综合排序由高到低分别是：‘台农1号’、‘马来西亚红’、‘化州红’、‘广西4号’、‘马来西亚香蜜’、‘广西3号’、‘台湾软枝’、‘广西1号’、‘台农3号’、‘新加坡黄肉’、‘大世纪’、‘新加坡红肉’、‘实生酸’、‘广西2号’、‘台湾秤锤’、‘台湾金星’、‘台农4号’、‘马来西亚B2’、‘台农2号’、‘香蜜’、‘马来西亚B10’。

表 7 不同种质主成分值及综合评价得分Table 7 Values of principal components and synthetic scores of different carambola germplasm accessions

3 讨 论

果实品质包括外观品质和食用品质，大小、形状、色泽等外观品质决定着果实卖相，而糖、酸、香味、矿质元素等食用品质决定着果实的营养价值。通过实生变异、种质杂交、生物技术等培育新种质是提升果实品质的重要途径，而优异亲本的选择是获得优良后代的物质基础[14-16]。关于种质资源果实性状多样性分析在石榴[17]、梨[18]、葡萄[19]、李[20]等多种果树中已有报道，而对于杨桃种质资源的研究相对较少。杨桃资源丰富，客观综合地认识杨桃种质资源果实外观和内在品质，对于杨桃种质资源评价与利用、育种目的确定以及通过分子生物学开展果实品质遗传基础研究具有重要意义。本实验从外观表型品质，以及糖、酸、矿质元素含量内在品质方面分析了21 份杨桃种质资源遗传多样性，发现不同种质间果实性状存在较大差异。因所有种质均生长在同一环境条件下，并采取同一的栽培管理方式，避免了环境和管理措施对果实品质的影响，该数据具有较高的参考价值。变异系数又称离散系数，反映了某一性状的变异程度，变异系数越大说明种质间性状变异的范围越大[21]。21 份杨桃种质25 项果实品质性状变异系数为7.44%～109.95%，其中酒石酸含量变异最大、其次为铁含量、柠檬酸含量和总酸含量，而纵径和SSC的变异系数最小，是较稳定的指标。在地方梨资源果实性状多样性分析时，张起[22]和曾少敏[23]等将变异系数较大的VC含量作为地方梨资源分类的重要指标。本研究中所测21 份杨桃果实酒石酸含量、柠檬酸含量和总酸含量变异系数均在70%以上，因此认为可以利用这3 个指标反映杨桃种质资源间的差异。

通过性状之间的相关性分析和聚类分析，本研究发现有些杨桃果实品质性状两两之间存在显著的正相关或负相关关系，如SSC与固酸比，果糖、葡萄糖、蔗糖、总糖含量及甜度值之间；部分性状之间存在明显相关性。在种质资源特性评价时，性状之间的相关性可为观测性状的取舍、简化评测指标体系提供参考依据。但同时也发现多数杨桃果实品质性状是相互独立的，它们之间的相关性并未达到显著水平。PCA是研究多个变量间相关性的一种多元统计方法，通过降维的算法利用较少的变量尽可能多地反映原变量的信息[24-25]。PCA已被广泛应用于荔枝[26]、芒果[27]、杏[28]、蓝莓[29]、苹果[30]等种质资源遗传多样性分析。本研究对21 份杨桃种质的25 项果实性状进行主成分分析，发现前两个主成分累积贡献率仅为42.13%，前7 个主成分的累积贡献率才达到81.63%，各性状之间的关系并非紧密，这与性状之间的相关性分析结果一致，所测各性状的累积贡献率增长不明显，各性状变异具有多向性。

根据杨桃各种质主成分得分和性状载荷，本研究发现第一主成分正向增长有利于提高果实含糖量和甜度值，第一主成分负向增长有利于增加果实大小；第二主成分的正向增长有利于提高果实矿质营养含量，第三主成分的正向增长有利于提高果实的有机酸含量。基于PCA，本研究计算了21 份杨桃种质的综合得分，排名顺序体现了各种质果实综合品质性状的优劣，其中排名前5位的依次是‘台农1号’、‘马来西亚红’、‘化州红’、‘广西4号’和‘马来西亚香蜜’，这些种质可作为优异候选种质，今后可结合果实发育特性、丰产性、抗逆性等方面的评价，做进一步筛选，最终为栽培推广及育种提供有价值的种质。