微小组织结构石蜡切片的制备

王慧丰，徐亦辰，赵文婧，陈维平

微小组织结构是指在组织工程构建过程中获得，具有体积小、结构相对简单等特点的组织样结构；与从成体器官分离、临床病理穿刺活检等途径获取的组织显著不同，因此在制备微小组织结构石蜡切片时，存在诸多问题。本科室根据微小组织的结构特点，通过改良和优化经典石蜡包埋、切片制备方法，分析适合微小组织结构石蜡包埋切片的制作方案，最终完成厚度为5 μm连续石蜡切片的制作，其蜡带完整，HE染色可见微小组织结构的细胞形态正常、着色效果好、色泽对比饱满、各层次结构完整，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞 选取第三代骨髓间充质干细胞，由广西医科大学基础医学形态学实验室提供。

1.1.2仪器设备 石蜡切片机(RM2235 cwEU，徕卡公司)；切片机刀片(徕卡 819)。益迪生物组织摊烤片机(YD-A、B，浙江金华益迪医疗公司)；电热恒温培养箱(DH2500，天津泰斯公司)；正置相差显微镜(尼康 ECLIPSE E100，日本)；包埋框；染色架；Corning 24孔细胞培养板(内径14 mm，美国康宁公司)等。

1.1.3试剂 石蜡切片，100%、95%乙醇，二甲苯，均购自天津市富宇公司。

1.2 方法

1.2.1取材 选用第三代骨髓间充质干细胞，加入胰腺组织诱导液进行定向分化诱导，连续培养50天，培养孔板内肉眼可见微小组织结构(图1)，经PBS冲洗，2%福尔马林固定30 min后，显微镜下机械剥离，移入小青瓶。

1.2.2脱水 梯度乙醇逐级脱水，每次8 min，其中100%乙醇脱水2次。具体操作步骤详见表1。

1.2.3透明 使用二甲苯对微小组织结构进行透明处理，微小组织结构大小为2 mm×1 mm×1 mm，经二甲苯透明2.5 min可充分使组织透明(表1)。

1.2.4浸蜡 石蜡二甲苯(1 ∶1)混合溶液处理30 min，石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别处理30 min，保证微小组织结构浸蜡充分(表1)。

1.2.5包埋 将60 ℃恒温箱内熔化的石蜡倒入包埋框内(材质：铜)，用预热的镊子将完成浸蜡的微小组织结构块埋于石蜡中，对包埋组织进行编号。

1.2.6切片 修整蜡块，保留微小组织结构蜡块边缘1 cm石蜡，调整组织块形态至易于切片的角度，调整切片角度和组织块位置，安装刀片，调整切片厚度为最大，至可见微小组织结构但未暴露微小组织结构的切面，调整切片厚为5 μm进行连续切片。随后用镊子夹蜡片，放入摊片机中进行展片。用载玻片捞片、储存。

1.2.7HE染色 根据微小组织结构特点，结合组织学书籍[1]及文献报道[2]确定适合染色方式，具体操作步骤：恒温箱60 ℃拷片30 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡10 min；二甲苯无水乙醇溶液(1 ∶1)水化5 min，100%、95%、80%、75%乙醇各5 min，二甲苯无水乙醇溶液(1 ∶1 )5 s，苏木精染液10 min，自来水洗浮色15 s，盐酸乙醇分化1 s，自来水返蓝30 min，伊红染液20 s，自来水或95%乙醇洗浮色并调整染色强度，经70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ乙醇脱水5 s，二甲苯无水乙醇溶液(1 ∶1)脱水5 s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ乙醇脱水15 s，适当晾干后，使用中性树脂封固。

2 结果

按照优化步骤操作，可顺利完成微小组织结构蜡块的制备(图2)，脱水后组织块无明显收缩，透明后浸蜡充分，组织与蜡块融为一体，无明显界限。采用徕卡超薄切片机，选择切片厚度为5 μm，可顺利完成微小组织结构连续切片的制作，切片的切面平整、边缘规则，切片内的组织完整，无碎裂、破损。铺片过程中无明显掉片、脱片。染色后细胞排列整齐、细胞形态正常、结构完整、染色均匀、色泽对比度好；各层次结构清晰，组织内可见中空结构，其游离面衬贴上皮组织(图3)。

3 讨论

组织工程是在体外特定培养条件下构建组织样结构，如组织工程化心肌、组织工程化胰岛等。微小组织结构以细胞成分为主，细胞间质成分少，体积小，多在1 mm3。肉眼下仅可见“米粒样”微小组织块，倒置显微镜下透光度差或不透光的团块。为了解组织结构、细胞形态及分布等，制备高质量的石蜡切片标本是最直观、最简便的技术方法。但经典石蜡切片技术多适用于成体器官的组织标本，组织结构稳定、有丰富的细胞间质，甚至含有结缔组织成分支持[3]。微小组织结构由于间质成分少或缺如、细胞比例较大等原因，导致结构松散，不易取材；标本体积过小，在后续实验操作中易丢失；不易控制脱水时间而导致细胞形态变化；透明时间掌握不好使组织变硬而导致切片时出现空洞。

表1 微小组织结构脱水、透明、浸蜡时间

①②③图1 微小组织结构肉眼可见体积小,仅为2 mm×1 mm×1 mm;较难观察细胞排列、形态及分布 图2 蜡块连续切片:切片的切面平整、边缘规则,切片内的组织完整,无碎裂、破损 图3 蜡块HE染色:染色后细胞排列整齐、细胞形态正常、结构完整、染色

微小组织体积小、结构松散，不易取材，操作过程容易导致组织受挤压而变形、结构破坏，因此在实际操作过程中，采取先固定，后取材的方式，尽量保持微小组织结构完整。根据间质少、细胞多的特点，反复探索后确定福尔马林固定液浓度为2%。微小组织结构的脱水是整个石蜡包埋步骤的关键。成体组织脱水步骤可从75%乙醇开始[4]，但微小组织缺少间质成分，高浓度脱水导致细胞失水过快，破坏组织的细胞形态，通过改良常规脱水步骤，调整起始浓度从50%乙醇开始，增加为6个浓度梯度、7次脱水步骤，适当延长脱水时间，保证脱水效果，减少由于快速脱水导致组织过度收缩、变形等情况。微小组织结构体积小，极容易透明过度导致组织“消失”或变硬，二甲苯透明时必须密切关注透明程度，提前准备对照组织初步探索透明时间，确保在透明完成瞬间终止透明。常规的浸蜡时间多为过夜[5]，为避免浸蜡过程中标本丢失，或浸蜡时间不足导致制作标本不理想，通过缩短浸蜡时间，增加浸蜡次数，改善浸蜡效果，保证组织周围及组织内无二甲苯残留。新买石蜡，经过反复冻融，可以改善熔点不同、杂质多等问题，为后续包埋提供良好的材料基础[6]。质量良好的切片，需要摸索出最佳切片机的切片角度，包括合理修片、根据调整组织块形状调整切片方向，尽量选择适宜微小组织结构的角度，可明显提高切片质量。此外，微小组织结构的染色时间与成体组织不同，需要反复多次在显微镜下观察着色效果，反复调整，最终确定HE染色时间。

本实验重点关注组织样结构的石蜡切片制备，通过改良和优化经典石蜡切片制备步骤，如组织固定、脱水、透明、浸蜡等，获得质量优良的微小组织结构切片，便于对微小组织结构的深入探索。