喉与下咽切除标本脱钙制片的优化处理

王德望，龚金梅，彭丽红，司明远，刘 梦，欧阳聪，张梦迪

钙化组织因含钙盐或磷酸盐多、质地硬，制片前需脱钙处理，才能制出完整的骨组织或其他硬组织病理切片[1-2]。临床工作中，组织脱钙一般以骨组织为材料，通常在脱钙前将所附软组织剔除后(仅附少量软组织)再进行脱钙处理。喉/下咽肿瘤的病变绝大部分起源黏膜病变，随病情发展渐累及外周组织及软骨，因病理诊断的需要，需制作喉/下咽软硬组织联合切片。如何制作满意的喉/下咽软硬组织联合切片，对于病理科是个技术挑战。本科室从脱钙液配制、组织分阶段分切、脱钙后残留酸处理等几个主要方面入手，进行相应的改进，对制作满意的喉/下咽软硬组织切片取得良好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2016年3月～2019年3月东南大学医学院附属南京同仁医院耳鼻咽-头颈外科手术切除的喉/下咽半切除或全切除标本90余例。

1.2 主要设备切骨刀，全自动组织脱水机，切片机，漂烘仪，染色机等。

1.3 试剂10%中性福尔马林液，复合酸脱钙液，85%乙醇溶液。

1.4 方法

1.4.1复合酸脱钙液配制 甲酸330 mL，16%中性缓冲福尔马林640 mL，盐酸10 mL，冰醋酸20 mL。

1.4.2组织固定 标本接收后，用常规10%的中性福尔马林固定3 h以上，再用切骨刀将喉标本沿纵轴将标本粗切成非完全性离断组织块，用复合酸脱钙液固定。注意事项：(1)组织未经脱钙不能直接用普通取材刀将组织切成薄块，因软组织与软骨或骨化组织质地不一，切时容易致软硬组织分离，造成组织撕脱，只能用切骨刀将标本切成粗块。(2)标本需常规固定一段时间后再行脱钙，因为组织经过固定后，可减缓酸对组织的损伤，如新鲜组织或组织未经有效固定即行脱钙处理，则可致红细胞溶解，制片后易形成含铁血黄素析出。

1.4.3分阶段分切 待钙化组织软化，切感比软组织质地稍硬，但能将软硬组织切成完整组织块时，将软硬组织切成0.3～0.5 cm厚组织片，再将组织块另装容器脱钙24 h，以保证充分脱钙。特殊标本特别是用于科研的标本，为力求组织的完整性、脱钙充分，在粗切脱钙软化后，也可先切成厚的组织块，根据实际需要充分脱钙后再将其修整为常规0.3 cm的组织块。分阶段分切，梯度将组织薄层处理，有利于脱钙完全(图1)

1.4.4祛酸处理 组织脱钙彻底后，需进行祛酸，祛酸如不彻底，组织制片后会导致细胞核染色不佳，严重者可使组织切片发灰，影响观察和诊断[3]。根据我们的经验，组织彻底脱钙后，第一天日间适当流水冲洗，夜间再行85%乙醇溶液浸渍，第二天日间再继续行流水冲冼，全过程约24 h，可保证后期达到满意的制片效果。

1.4.5常规脱水、制片 喉/下咽切除标本组织块经脱钙祛酸后，随其它组织常规进行脱水、包埋制片。

2 结果

本组采用该方法处理的喉/下咽切除标本，因没有进行软骨的剔除，组织结构完整，喉黏膜、韧带、肌组织及伴或不伴骨化的软骨一应俱全，易于判断肿瘤的侵犯层次。同时，由于组织分阶段分切、脱钙，其脱钙彻底，组织完整，无脱钙不完全制片后的组织空洞形成。组织祛酸彻底，HE染色色泽鲜艳，与常规非脱钙组织无明显区别(图2～4)，而无脱钙后祛酸处理不佳的组织切片发红，核不着色的现象。

3 讨论

喉/下咽管壁本身及外周均有较硬的钙化组织或伴有不完全钙化的软骨组织，喉/下咽肿瘤大多来源于黏膜，起源于黏膜的恶性肿瘤随病情发展逐渐向深层、外周组织(如甲状软骨)侵犯，侵犯层次越深，或累及外周组织越广泛，则临床分期越高，预后则越差[3-4]。因此，喉/下咽肿瘤标本应进行脱钙处理，观察肿瘤对外周及软骨的侵犯，严格进行病理分期，为临床医师提供更多诊断信息以利于充分进行预后评估。

①②③④

目前尚未有喉/下咽软硬组织脱钙处理的文献报道，喉/下咽软硬组织联合脱钙难度较高，可能主要受以下几方面因素影响：(1)喉/下咽管壁及外周均有软骨，但其硬化程度比真正的骨质钙化程度低，常用的骨标本脱钙液并不完全适用喉标本脱钙，因其浓度较高，易损伤组织。(2)喉/下咽软硬组织的组织致密度、硬度不一，不能像骨组织一次性锯成常规取材所需的0.3～0.5 cm组织块。(3)现阶段对于组织脱钙后祛酸处理主要是对硬组织的研究，较少关注到软硬组织整体脱钙后，软组织中易蓄积酸性脱钙液。

本组复合酸脱钙液以弱酸为主，配以低浓度的强酸为辅，并辅以穿透性强，且具有一定组织膨胀作用的冰乙酸，脱钙效果比单纯弱酸脱钙液快，对组织的损伤比单纯强酸脱钙液小[5]。喉/下咽软硬组织制片不适合简便操作，强行一次性分切会导致软硬组织相互分离，只有分阶段分切，将组织梯度薄层处理，才有利于保持组织的完整性及脱钙彻底。多数文献报道[6-7]经弱酸脱钙后的组织流水冲洗30 min即可，但我们发现喉软硬组织脱钙后一般需冲洗24 h效果较好，而30 min的冲冼时间过短会影响制片后的着色效果，可能大多数脱钙研究的资料为分离软组织后的骨组织，组织中含酸相比软组织中含量较少有关。另外，笔者发现脱钙后组织如冲洗不充分，直接进入脱水程序，如脱钙组织块多、含酸量多的情况下，则会污染整批次的组织，导致染色效果差。根据脱水原理，我们认为可能乙醇在脱水的过程中将组织内的酸随脱水而释放出来。因此，我们在流水冲洗过程中特意设置一个重要环节，在组织脱钙后流水冲洗祛酸的环节中增加乙醇溶液浸渍过程，该过程的改良可以使祛酸更彻底，同时比夜间流水冲冼更安全。

本组采用喉/下咽标本的处理获得较好的制片效果，有利于临床病理诊断和肿瘤分期，但整个组织处理时间较长，而使诊断周期偏长。有研究表明脱钙过程中联合使用超声波技术可加快分子运动[8-9]，预计可加速组织脱钙及祛酸过程，从而缩短组织脱钙处理过程。本实验仅限于喉/下咽切除标本的软硬组织HE常规制片效果观察，对其脱钙祛酸后残留酸的客观判定以及软硬组织联合制片的免疫组化染色效果等未作深入分析，后期我们将进一步深入探讨，为病理制片提供参考。