荧光染色在隐球菌病石蜡包埋组织中的应用

王 琦，王晓秋，顾 萍，李传应

隐球菌广泛存在于土壤、鸽粪和树洞中，为条件致病菌[1]。随着HIV感染、抗生素以及免疫抑制剂使用的增加，隐球菌感染逐渐增多。该病主要侵犯中枢神经系统和肺脏，其次是皮肤、肾脏等，起病隐匿，临床表现复杂多样，易误、漏诊[2-4]。隐球菌感染的治疗与早期正确的诊断密切相关。近年荧光染色在真菌感染的检测中应用越来越多，但多集中在浅部真菌或体液等新鲜样本的涂片检测[5-6]，在石蜡包埋组织中的应用却鲜有报道。本文收集12例病理诊断的隐球菌病，探索荧光染色在石蜡包埋组织中检测隐球菌的潜在应用价值，并和特殊染色做比较，以期找出效果最佳的隐球菌显色方法。

1 材料与方法

1.1 材料选取2017～2019年中国科学技术大学附属第一医院存档的隐球菌感染标本12例，其中肺部感染9例，皮肤感染2例，鼻腔感染1例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，60 ℃烤片1～2 h。

1.2 方法

1.2.1HE染色 石蜡切片脱蜡至水，苏木精染色5 min，1%盐酸乙醇分化，水洗，伊红染色30 s，常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.2荧光染色 石蜡切片脱蜡至水，添加一滴真菌荧光染色液覆盖于标本上，盖上盖玻片，使其与标本充分结合。染色1～2 min，用滤纸吸取玻片周边多余染液，于荧光显微镜下观察。

1.2.3PAS染色 切片脱蜡至水，高碘酸氧化10 min，水洗，Schiff试剂染色10～15 min，流水冲洗，苏木精复染2 min，常规脱水透明，中性树胶封固。

1.2.4六胺银染色 配制六胺银工作液：将5滴5%的硝酸银缓慢加入5 mL 3%的乌洛托品溶液中，边加边摇，至白色沉淀溶解，然后加入2 mL 5%的四硼酸钠溶液，最后加入25 mL蒸馏水，混匀待用。六胺银染色步骤：切片脱蜡至水，高碘酸氧化10 min，水洗后放入工作液中，65 ℃烤箱染色40～60 min，期间经多次显微镜下观察，0.2%氯化金调色，硫代硫酸钠固定2 min，伊红复染，常规脱水透明，中性树胶封固。

2 结果

4种方法均能染出隐球菌。HE染色：隐球菌呈现隐约的淡红或淡蓝色，有时不着色，轮廓不明显，圆形或椭圆形，不易观察(图1)。荧光染色：隐球菌菌壁呈亮蓝色，背景蓝黑色，隐球菌结构清晰，反差明显(图2)，染色48 h后，菌壁亮蓝色减弱(图3)。PAS染色：隐球菌菌体中间淡染，菌壁呈紫红色，细胞核显蓝色，背景淡红色至红色，反差较弱(图4)。六胺银染色：隐球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑色，中间为淡染区，用伊红复染时，背景为红色(图5)。

3 讨论

隐球菌为酵母型真菌，圆形或椭圆形，直径3～20 μm，菌体周围被一厚3～5 μm的强折光性荚膜包绕，由黏多糖物质组成。近年隐球菌感染越来越多，明确诊断对隐球菌病的治疗有重要的指导作用。但是该病临床表现各异，缺乏特征性的影像学表现，诊断具有一定的挑战性[2-4]。

组织病理学检查是诊断隐球菌感染的重要手段，在病变组织中查见隐球菌病原体便可确诊。常规HE染色有时仅显示病灶内隐球菌呈淡红、淡蓝或不显色的圆形空泡状小体，若医师经验少或观察不仔细，易漏诊，常需借助特殊染色进行检测。PAS染色和六胺银染色是常用的显示隐球菌的特殊染色方法。两种染色均是利用氧化剂氧化隐球菌菌壁的多糖，暴露出醛基，再分别与Schiff试剂或银离子发生反应，使菌壁呈现出相应的紫红色或黑色。然而，这两种染色方法对于所有的真菌孢子均为阳性反应，特异性较差。

真菌荧光染色液是荧光增白剂和氢氧化钾的混合溶液，荧光增白剂是一种染料，能够与真菌细胞壁的几丁质和纤维素特异性结合而使菌体着色，在波长为340～380 nm的紫外光照射下，会发出亮蓝色的荧光[7]。荧光染液中的KOH成分不仅可以溶解组织细胞、角蛋白和脂肪等组织碎屑，使组织透明化，还可以去除背景中的干扰荧光，提高与背景的反差。近年荧光染色在真菌感染的检测中应用越来越多，但多集中在浅部真菌或体液等新鲜样本的快速检测，如各种毛发、甲屑、皮屑、痰液、角膜涂片和阴道分泌物等，与传统的KOH湿片法相比，荧光染色具有敏感性强、阳性率高的特点[5,8]。然而，荧光染色法在石蜡包埋组织中的应用却鲜有报道。

①②③④⑤

本实验将荧光染色用于隐球菌病石蜡包埋组织标本的检测，荧光染色结果和PAS染色及六胺银染色结果一致，但是荧光染色隐球菌菌壁呈亮蓝色，背景呈蓝黑色，反差更明显，菌体结构更清晰。相比之下，PAS染色虽然操作也很简单，但其还能显示组织中的糖原、中性黏液、基膜和一些炎症细胞等，背景呈红色，与隐球菌紫红色菌壁反差不明显，影响结果的判读，易漏诊。六胺银染色结果反差明显，背景为红色，菌壁呈深黑色，隐球菌容易辨认，但是染色操作复杂，整个过程持续时间较长，需多次进行显微镜观察，并且切片易受银沉淀污染，对玻璃仪器的清洁度要求较高。荧光染色步骤简单，滴加染液后仅需1～2 min便可进行镜下观察，也有报道称荧光染色标本镜检的时间可缩短至30～60 s[9]，大大提高了染色的效率。荧光染色后的切片也可以重复使用，节省了制片的成本。需要注意的是，荧光染色法组织中的弹力纤维以及玻片上存在的少量纤维也可发出荧光[7-8]，但其形态与隐球菌有较大差异，凭经验一般可以避免假阳性情况的发生。考虑到荧光淬灭快，制片后需尽快进行镜下观察和拍照。本实验发现石蜡包埋组织隐球菌荧光染色后，一般可在暗处存放2～3天，荧光逐渐减弱，背景开始增强。

综上所述，本实验证实了荧光染色法在石蜡包埋组织中检测隐球菌的可行性。该方法操作简便、快捷省时，染色结果直观明确。随着荧光显微镜使用的增多，荧光染色法是检测隐球菌病石蜡包埋组织的一种快速有效方法。