5种固定液对淋巴结冷冻切片HE及免疫组化染色效果的影响

王 鸿，周 晟，代 鹏

淋巴结组织纤维成分少，淋巴细胞丰富，往往还附有较多的脂肪组织，在制片过程中容易出现裂纹、细胞核皱缩、染色模糊甚至是脱片等，如需改善应严格控制冷冻的温度和时间，挑选渗透力强、固定作用强的固定液。本文通过对固定液配方的探索，着重与病理医师交流制片的方法与经验，以提高淋巴结组织冷冻切片优良率。

1 材料与方法

1.1 材料选取2019年1～3月我院手术室送检淋巴结组织标本30例，其中乳腺前哨淋巴结12例，中央组淋巴结14例，其它淋巴结4例。所有组织均符合快速病理标本送检要求。

1.2 试剂与器材德国Leica-CM1950恒温冷冻切片机；进口OCT胶水；徕卡DB-80刀片；组织防脱玻片；常规HE染色试剂；中性树胶；抗体CD3、CD20购自北京中杉金桥公司，二抗和DAB显色液购自Dako公司；10%中性福尔马林(成品)、95%乙醇、丙酮、甲醇、改良AAF固定液(15 mL 10%中性福尔马林、40 mL丙酮、43 mL苦味酸饱和无水乙醇液、2 mL冰醋酸)；将它们分成10%中性福尔马林组、乙醇组、丙酮组、甲醇组和AAF组。

1.3 方法用OCT胶水将组织环绕包埋覆盖，置于-18 ℃冷冻台中速冻约2 min，4 μm厚连续切片15张，快速放入不同固定液中固定2 min(除10%中性福尔马林为室温固定外，其它均为低温固定，低温固定可以避免温度骤变引起的细胞变化)，每种固定液3张切片，1张行HE染色，另2张行CD3和CD20染色。HE染色流程为常规的冷冻切片HE染色。免疫组化染色流程：3%双氧水封闭10 min，PBS冲洗3次，每张切片滴加100 μL一抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加100 μL二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 结果判断从本科室30名诊断医师中随机抽取2名医师对5组切片染色结果进行双盲法评分。HE切片根据组织结构、细胞形态、细胞核(质)染色强度、核质对比度进行评分。CD3、CD20免疫组化染色按组织结构、细胞形态、阳性强度、阳性定位、背景染色进行评分。单项满分为10分，最差为0分，5项检查合计满分为50分，若不能满足临床诊断则直接记为0分。

2 结果

2.1 HE染色经10%中性福尔马林固定的切片：镜下组织结构不清晰，细胞核皱缩，胞质着色不良，核染色和胞质染色对比度差(图1)。经95%乙醇固定的切片：镜下可见较清晰的组织结构，但细胞核存在收缩现象，细胞核染色模糊，细胞质染色效果不佳，着色不鲜艳(图2)。经丙酮固定的切片：镜下组织结构较清晰，有核溶解现象，胞质染色不佳，核染色和胞质染色对比度尚可。经甲醇固定的切片：镜下组织结构较完整、清晰，细胞核形态较完整，部分有核溶解现象，胞质染色尚清晰，核染色和胞质染色对比度较好(图3)。经改良AAF固定的切片：镜下可以看到清晰的组织结构，细胞核和细胞质染色效果清晰，颜色鲜艳，两者对比效果明显(图4)。

2.2 免疫表型经10%中性福尔马林固定的切片，CD3、CD20染色均出现不少的假阴性，影响临床诊断(图5)。经95%乙醇固定的切片，组织结构较清晰，染色阳性强度和定位较好，背景较清晰(图6)。经丙酮固定的切片，CD3、CD20均出现较多的非特异性染色。经甲醇固定的切片，组织结构完整清晰，阳性强度和定位较好，背景清晰(图7)。经改良AAF固定的切片，组织结构完整清晰，阳性强度好，定位准确，背景清晰(图8)。

2.3 评分在HE、CD3和CD20染色评分中，5组平均得分差异均有统计学意义(P均<0.001)，平均得分AAF>甲醇>乙醇>丙酮>10%中性福尔马林，进一步两两比较，福尔马林组与其它4组平均得分差异有统计学意义(P均<0.05)；乙醇组与丙酮组平均得分差异无统计学意义(HE中P值为0.73；CD3中P值为0.96；CD20中P值为0.45)；AAF组与其它4组平均得分差异有统计学意义(P均<0.001，表1)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表1 5组不同固定液固定切片染色评分

3 讨论

冷冻切片是一种快速制片技术，在外科手术和病理科中较为常见，其将病理组织冷冻至一定硬度后再进行切片处理[1]。冷冻HE切片制作需时间短、质量高，其诊断的准确性影响临床手术方案的制定。但影响冷冻切片质量的因素较多，其中一项最重要的因素是冷冻切片的固定，因此选择合适的固定液对冷冻切片的HE染色质量有十分重要的影响[2]。固定作用在于使蛋白变性、凝固、沉淀，保持细胞、组织原有的形态结构，使水溶性物质扩散，抑制酶的活性，保持细胞膜的完整性，防止切片模糊；同时，能使组织中各物质沉淀和凝固后产生不同的折射率，使染色后的切片利于观察[3]。

淋巴结组织在取材过程中往往会夹杂着较多的脂肪组织，应与取材医师有效沟通去除诊断无关的脂肪组织，原则上同一冻头上不要超过3枚淋巴结组织，对于较大的淋巴结应剖开取材[4]。淋巴结组织细胞密集，呈块状，细胞核染色深，冷冻切片中淋巴细胞易收缩，给诊断带来一定难度。因此，决定了淋巴结组织在冷冻切片中对固定液选择和染色过程中条件选择的特殊性。

10%中性福尔马林是HE染色中最常用的固定液之一，但其在冷冻切片中表现欠佳，可能与10%中性福尔马林成分中含水量较多、无法低温固定，造成了组织自溶，不适应于对冷冻切片组织进行快速固定的样本，而石蜡切片对组织缓慢渗透的固定效果良好，免疫组化标记CD3和CD20中均出现不少的假阴性，可能与未进行修复、抗原决定簇封闭有关。乙醇具备固定兼脱水功能，能够将切片上的水分去除，从而使切片的组织结构得以完好的保存下来，并且能够使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀会在水中溶解，从而使着色效果不佳。除此之外，乙醇还会形成一层蛋白膜覆盖在组织表面，使固定液和染液不能较好地渗入，从而对染色质量产生不良影响[5]。丙酮为单纯性固定剂，能使蛋白质沉淀，渗透力强，在一部分组织中对核的固定欠佳，着色不良[6]，在本实验中细胞核染色淡，收缩明显，且更容易脱片，CD3和CD20染色均出现较多的非特异性染色。甲醇为沉淀类固定剂，对组织渗透性强，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白，甲醇有着乙醇的收缩作用，收缩性比乙醇小[7]，对淋巴结组织的固定有较好的效果，但细胞核仍有收缩，核质对比度还不够鲜明。改良的AAF固定液是一种复合固定液，由无水乙醇、甲醛、丙酮、冰醋酸、苦味酸按一定比例混合，苦味酸能沉淀一切蛋白质且对组织无明显硬化作用，甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，丙酮和冰醋酸均能使组织膨胀，联合应用既能抵消乙醇固定引起的组织高度收缩和硬化，又能加速固定，兼备快速脱水和固定作用。本实验中经改良AAF固定液制作的淋巴结切片组织结构、细胞形态、胞质对比度均优于其它固定液。

综上所述，改良的AAF固定液能够显著提高淋巴结组织冷冻切片的优良率，配置简单，值得临床推广。