喉鳞状细胞癌中BRAP和VEGF-C的表达及其与淋巴管生成的关系

殷文娟，张 玲，刘青华，白 玮，王志华，李雅俊，李灵敏

淋巴道转移是喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)主要的转移方式，对肿瘤预后复发有重要影响[1-2]。在转移过程中，淋巴管生成伴微淋巴管密度(micro-lymphatic vessel density, MLVD)增加，为肿瘤细胞进入淋巴管提供了更多可能。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是VEGF家族最重要的因子之一，被认为是能诱导肿瘤淋巴管新生及促进肿瘤淋巴结转移的重要因素[3-4]。

近期研究发现高表达BRCA1相关蛋白(BRCA1-associated protein, BRAP)与LSCC淋巴结转移有关[5]，但其具体作用机制尚不明确。本文检测84例LSCC组织中BRAP和VEGF-C蛋白表达，探讨两种蛋白在LSCC淋巴结转移中的作用关系及对MLVD的影响，为进一步阐明LSCC的转移机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2011年1月～2013年12月山西省肿瘤医院LSCC患者手术切除的石蜡标本84例。患者术前均未行放、化疗，其中男性81例，女性3例，年龄38～79岁。有淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者64例。另收集距癌组织边缘0.5 cm以上的癌旁组织标本15例作为对照组。所有组织标本由山西省肿瘤医院病理科医师确诊，患者均有完整的临床资料。

1.2 试剂BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗体购自Proteintech公司；鼠抗人D2-40单克隆抗体(工作液)购自Zsbio公司；免疫组化PV 6000试剂盒购自Zsbio公司。

1.3 免疫组化采用免疫组化PV 6000法染色，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。BRAP、VEGF-C兔抗人多克隆抗体工作浓度分别为1 ∶400和1 ∶200，同时用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断免疫组化染色结果由两位病理科医师采用半定量分析法判定。BRAP、VEGF-C蛋白均主要表达于细胞质，呈棕黄色颗粒。参考Liu等[6]方法，镜下随机选取5个400倍视野进行阳性细胞着色程度评分和阳性细胞百分比评分。(1)按阳性细胞着色计分：细胞无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比计分：≤25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。两项得分结果相加为蛋白的表达水平：0～3分为低表达，4～6分为高表达。

1.5 MLVD计数D2-40表达于微淋巴管内皮细胞的胞质，呈棕黄色。微淋巴管计数参考Zheng等[7]方法，先在100倍镜下寻找微淋巴管最密集的2个区域即“热点”，然后200倍镜下在每个热点区域随机选取5个视野进行微淋巴管计数(不包括管腔直径超过8个红细胞或管壁存在平滑肌的淋巴管)。结果采用2个热点区域合计10个视野内微淋巴管数目的平均值作为MLVD。

2 结果

2.1 LSCC及癌旁组织中BRAP和VEGF-C的表达免疫组化PV 6000法检测84例LSCC及15例癌旁组织中BRAP、VEGF-C的表达，两种蛋白均位于细胞质中，呈浅黄至棕色(图1、2)。LSCC组织中BRAP、VEGF-C的高表达率分别为65.5%、53.6%，明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 LSCC组织中BRAP、VEGF-C表达与淋巴结转移的关系有淋巴结转移组中BRAP、VEGF-C表达高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 喉鳞状细胞癌组织中BRAP、VEGF-C表达与淋巴结转移的关系

2.3 BRAP与VEGF-C表达的相关性84例LSCC组织中，BRAP和VEGF-C同时高表达者37例，高表达率为44.0%，同时低表达者21例，低表达率为25.0%。LSCC组织中BRAP与VEGF-C的表达呈正相关(χ2=12.024，P<0.01，C=0.354，表3)。

表3 BRAP与VEGF-C表达的相关性

2.4 淋巴结转移与MLVD值的关系D2-40阳性定位于淋巴管内皮细胞的胞质，呈棕黄色(图3)。在LSCC组织中，D2-40位于癌周。LSCC组织和癌旁组织MLVD值分别为16.39±4.55、7.27±2.25，差异有统计学意义(t=11.927，P<0.01)；淋巴结转移组的MLVD值高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(t=9.387，P<0.01，表4)。

2.5 BRAP、VEGF-C表达与MLVD的关系比较BRAP、VEGF-C蛋白不同表达组的MLVD值，结果显示高表达BRAP、VEGF-C组MLVD值分别高于低表达组(P<0.01，表5)。

①A①B②A②B③图1 喉鳞状细胞癌及癌旁组织中BRAP的表达,PV 6000法:A.癌旁组织;B.LSCC组织图2 喉鳞状细胞癌及癌旁组织中VEGF-C的表达,PV 6000法:A.癌旁组织;B.LSCC组织图3 喉鳞状细胞癌组织中D2-40的表达,PV 6000法

表4 淋巴结转移与MLVD的关系

表5 BRAP、VEGF-C表达与MLVD的关系

表1 喉鳞状细胞癌及癌旁组织中BRAP、VEGF-C的表达

3 讨论

LSCC是耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤，其主要发生淋巴结转移。淋巴结是否转移直接影响LSCC的治疗方式、局部复发和预后[8]。因此，分析LSCC淋巴转移的相关机制对LSCC的早期诊断、及时治疗具有非常重要的意义。

BRAP又称BRCA1相关蛋白，能够识别BRCA1的信号肽。BRAP调控细胞的分化、生长、侵袭、迁移[9-10]。既往研究显示BRAP基因多态性和结直肠癌的发病风险相关[11]。Zhao等[10]研究显示BRAP是食管癌细胞侵袭迁移相关基因，并促进裸鼠转移瘤的形成。我们最近发现BRAP在LSCC组织中高表达，且其表达与LSCC的淋巴结转移密切相关[5]。

VEGF-C是VEGF家族成员，被认为是重要的淋巴管内皮生长刺激因子，其在多种恶性肿瘤中呈高表达[4]。VEGF-C与淋巴管内皮细胞表面受体VEGFR-3特异性结合后，刺激靶细胞增殖，从而诱导淋巴管的增生及MLVD增高，促进肿瘤淋巴结转移[3]。已有研究证实在多种恶性肿瘤包括喉癌中，VEGF-C高表达促进MLVD增高，与肿瘤淋巴结转移密切相关[7,12]。

本实验结果显示，BRAP、VEGF-C在LSCC组织中均呈高表达，且与淋巴结转移显著相关，提示两者在LSCC淋巴结转移过程中有促进作用。BRAP、VEGF-C高表达时MLVD值均显著增高，提示BRAP、VEGF-C可能通过诱导淋巴管生成促进LSCC淋巴结转移。

统计学分析显示，BRAP与VEGF-C在LSCC中的表达呈正相关，提示两者在LSCC的淋巴管生成及转移中呈协同作用。Ozaki等[13]对冠脉内皮细胞的研究证实敲降BRAP的表达可以抑制NF-κB信号通路，而VEGF-C是NF-κB调控肿瘤侵袭转移重要的下游通路；Zhao等[10]对食管癌的研究中，从免疫组化染色和细胞水平的实验证实了BRAP和VEGF-C的表达呈显著正相关，且BRAP对VEGF-C的调控是通过NF-κB通路实现的。以上研究与本组实验结果中BRAP与VEGF-C呈显著正相关结果一致，提示LSCC中高表达的BRAP有可能通过NF-κB途径刺激VEGF-C的表达。目前，关于BRAP在LSCC淋巴结转移过程中的作用机制及其与VEGF-C的关系尚待进一步分析。

综上所述，BRAP、VEGF-C在LSCC中高表达，均与肿瘤的淋巴结转移密切相关。抑制BRAP的表达，可能通过下调VEGF-C而减少淋巴管生成及淋巴道转移的概率。