京大戟对斑马鱼胚胎血管生成的影响

梁文举，倪璐，张文婷，陈扬，刘妍，刘静，赵苑伶,林瑞超，郝巨辉,马志强*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102; 2.中药品质评价北京市重点实验室，北京 100102)

研究表明，抗血管新生疗法是以血管内皮细胞为靶点，通过降低血管活性因子的活性、抑制内皮细胞增殖和迁移、改变肿瘤生长微环境，从而抑制肿瘤生长过程所必需的血管新生，切断肿瘤的供养，最终达到遏制肿瘤生长和转移目的一种肿瘤治疗方法[1-2]；该方法具有高效特异性、不易产生耐药性、药物易于到达靶部位和毒副作用小等优点，可以有效地抑制肿瘤的生长、转移和复发，现在已成为抗肿瘤血管生成药物研究的热点之一[3-4]。在抗血管药物活性筛选中，斑马鱼因其高通量，给药方便、胚胎透明、胚胎发育快、血管生成模式简单且在显微镜下可直接观察到血管形态等优点，已成为筛选抗血管生成药物的理想动物模型[5]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管新生活性，但其物质基础尚未明确[6]。活性导向是对中药化学成分分离、探索中药活性物质基础的重要方法。故本研究采用斑马鱼为模型动物，以抗血管生成活性为前提，探究京大戟不同极性提取部位对斑马鱼胚胎血管生成的影响，为阐明京大戟抗血管生成的化学物质基础提供依据。

1 实验材料

1.1 主要仪器和试药

京大戟饮片(购自河北安国药材市场，经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为正品)；斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)；Axio Zoom V16体式荧光显微镜(Zeiss，Germany)；HQ10-20H超纯水仪(长沙聚丰环保科技有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BPZ-6033LC真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；MS205DU电子分析天平(瑞士METTLER公司)；LRH-250Z型恒温生化培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司)；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液器(德国Eppendorf公司)。

1.2 实验动物

转基因斑马鱼Tg(flk1:mCherry)(中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心)。

1.3 试剂与耗材

氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、七水硫酸镁、碳酸氢钠等均为分析纯(北京化工厂)；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等均为分析纯(北京化工厂)；15 cm玻璃培养皿，12孔板、锡箔纸、巴斯德吸管，Vatalanib 2HCl(PTK787)(Selleck Chemicals,Houston,TX)。

2 方法

2.1 斑马鱼成鱼饲养及胚胎繁殖

饲养条件：北京爱生斑马鱼繁殖系统，全封闭循环，水温(28±0.5)℃，pH值7.2～7.4，电导率530～550 μs/cm，14 h∶10 h明暗交替。

胚胎繁殖：选择生长状态良好的斑马鱼以雌雄比为1∶1进行繁殖，用隔板将雌雄斑马鱼分开，于次日清晨抽去隔板，繁殖完成后，将成鱼取出放回养殖系统，收集状态良好的斑马鱼胚胎，置于28.5 ℃恒温培养箱孵育。

胚胎培养水的配制：按照Zebrafish Book标准配制：0.137 mol/L NaCl、5.4 mol/L KCl、0.25 mol/L Na2HPO4、0.44 mol/L K2HPO4、1.3 mol/L CaCl2、1.0 mol/L MgSO4、4.2 mol/L NaHCO3的水溶液。

2.2 京大戟不同极性部位的提取

京大戟饮片粉碎过40目筛，称取20 g，精密称定，置索氏提取器中，分别以10倍体积量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇为提取溶剂，按序依次回流提取，每次提取均至索氏提取器回流管中提取液无色，更换提取溶剂时需挥干上一种提取溶剂，分别收集各提取液，减压浓缩，真空干燥至恒重，称重研磨粉碎待用。

2.3 京大戟不同极性部位对斑马鱼胚胎血管生成的影响

在体式显微镜下挑选发育良好且胚胎发育至6 hpf(hours past fertilization，即受精后小时数)的鱼卵。将挑出的鱼卵置于12孔板中，每孔20只胚胎，分别暴露在3 mL不同对照组及供试组溶液中。根据预实验结果，以含有0.1% DMSO的胚胎培养水作为溶剂，分别配置浓度为10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的京大戟石油醚提取物(PET)、二氯甲烷提取物(DCM)、乙酸乙酯提取物(EA)，以及浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL甲醇提取物(MeOH)供试品溶液。同时，给予浓度为100 ng/mL的PTK787为阳性对照组；以及含有0.1% DMSO的胚胎培养水为空白对照组。每24 h更换一次培养液，在28 ℃下、在14 h/10 h的昼夜周期中培养至72 hpf，在体式显微镜下观察节间血管生成情况并拍照，统计完整节间血管数[完整的血管指的是斑马鱼节间血管能够连接背纵吻合血管(DLAV)和背主动脉(DA)的节间血管]。平行重复3次。

2.4 京大戟甲醇提取部位的不同洗脱组分对斑马鱼胚胎血管生成的影响

根据不同极性部位结果，选取毒性较低，活性较好的甲醇部位进行下一步硅胶柱层析分离纯化，使用20% ～ 100%的甲醇水溶液梯度洗脱，得到20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇,共5组洗脱组分，减压浓缩，真空干燥至恒重，称重研磨粉碎待用。以含有0.1% DMSO的胚胎培养水作为溶剂，均配置成浓度为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的供试品溶液，显微镜下选取发育良好且胚胎发育至6 hpf的鱼卵，按“2.3”项下处理，对洗脱部位的活性进一步进行考察。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 京大戟不同极性部位对斑马鱼节间血管生成的影响

结果显示，空白对照组斑马鱼节间血管生长良好，节间血管呈均匀纵向排列，完整无缺失，无断裂。阳性对照组斑马鱼体节间血管缺失明显。石油醚提取部位处理组处理组斑马鱼节间血管均匀纵向排列，完整无缺失，对斑马鱼胚胎血管生长无明显抑制作用(P>0.05)，二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇提取部位3组处理组斑马鱼节间血管均出现血管缺失现象，对斑马鱼胚胎血管具有明显的抑制作用，且随着给药浓度的升高，抑制作用增强。但在实验过程中，观察到经石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取部位处理过的斑马鱼幼鱼在所有浓度下均出现卵黄肿大、体态弯曲和部分死亡现象，且随着剂量增大，死亡和致畸数量增多，在40 μg/mL以上全部死亡，这一现象表明这三种极性提取部位毒性较强。具体见表1、图1。

表1 京大戟不同极性部位对斑马鱼节间血管生成情况的影响

注：A.石油醚组；B.二氯甲烷组；C.乙酸乙酯组；D.甲醇组。图1 京大戟不同极性部位对斑马鱼胚胎节间血管生成的影响

3.2 京大戟甲醇层不同部位对斑马鱼节间血管生成的影响

结果显示，空白对照组斑马鱼节间血管生长良好，节间血管呈均匀纵向排列，完整无缺失，无断裂。阳性对照组斑马鱼体节间血管缺失明显。5组京大戟不同甲醇洗脱部位处理组均出现血管缺失现象，即5个处理组的血管生成均受到一定程度的抑制。在统一设定的3个浓度下，20%甲醇和80%甲醇洗脱部位对斑马鱼节间血管的抑制呈浓度依赖性；其余3个处理组的抑制效果无浓度依赖关系。具体见表2、图2。

3.3 京大戟20%、80%甲醇洗脱部位和甲醇提取物抑制血管生成活性对比

对京大戟甲醇提取部位与20%、80%甲醇洗脱部位进行比较，结果显示，在相同给药剂量下，甲醇提取部位和20%、80%甲醇洗脱部位对斑马鱼节间血管生成均有抑制效果，且随着浓度增大，抑制效果增强。其中20%、80%甲醇洗脱部位抑制效果强于甲醇提取部位。具体见图3。

表2 京大戟甲醇不同组分部位对斑马鱼节间血管生成情况的影响

注：A.20%甲醇洗脱部位；B.40%甲醇洗脱部位；C.60%甲醇洗脱部位；D.80%甲醇洗脱部位；E.100%甲醇洗脱部位。图2 京大戟甲醇提取物不同部位对斑马鱼节间血管的抑制作用

注：A.甲醇提取部位；B.20%甲醇洗脱部位；C.80%甲醇洗脱部位。图3 京大戟20%、80%甲醇洗脱部位和甲醇提取物抑制血管生成活性比较

4 讨论

新血管的形成能加速肿瘤的生长发育并促进转移，肿瘤新生血管的形成是以血管生成的方式发生的[7-8]，若能抑制肿瘤血管生成，则可达到抑制肿瘤生长和转移的目的，因此，“抗血管生成疗法”已成为肿瘤靶向治疗的重要研究领域之一[9]。

前期研究表明，京大戟水提物具有抗血管生成效果，其中mRNA结果显示，京大戟水提物可抑制部分肿瘤血管生成的相关基因的表达，但其物质基础尚未明确[6]。本研究以抗血管生成活性为导向，采用血管荧光标记的转基因斑马鱼为模型动物，探究京大戟石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇四种不同极性部位提取物对斑马鱼胚胎节间血管的影响。结果显示，京大戟石油醚提取物对斑马鱼胚胎节间血管生成无抑制作用，剩余三种对斑马鱼胚胎节间血管生成具有抑制作用，且均呈剂量依赖性。这可能是由于三种有机试剂在提取过程中存在不同极性成分的重叠造成的，即使用不同极性的溶剂在连续提取过程中无法将成分按照极性的不同区分开。此外，不同极性的提取溶剂在斑马鱼胚胎毒性表现上具有较大的区别。石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯三种提取部位具有较强的毒性，在较低的给药范围内，斑马鱼胚胎均出现体态弯曲、卵黄肿大，乃至死亡。在相同疗效下，甲醇提取物组虽给药浓度较大，但安全性更好，在给药范围内，未出现致畸和死亡现象。

本研究结果表明二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇三种不同极性提取部位对斑马鱼胚胎血管生成具有较好的抑制作用，综合毒性和活性表现，选择甲醇提取部位进行进一步分离纯化。不同浓度的甲醇洗脱溶液对斑马鱼胚胎血管生成均具有不同程度的抑制作用，其中20%甲醇和80%甲醇两组呈浓度依赖性。为后续京大戟抗血管生成的物质基础研究提供了参考和依据。