益气养阴方对急性白血病细胞HL-60增殖和细胞形态的影响

孙静，李笑，马丽芳，张发艳

(山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355)

急性白血病是骨髓或造血组织中原始及幼稚血细胞大量异常急骤增生的恶性疾病，在血液系统疾病中危害性极高。我国的白血病死亡率为3.78/10万，是肿瘤死亡的十大死因之一[1]。急性白血病在35岁以下人群中死亡率居首位，成人急性髓系白血病化疗缓解率约为50%～70%，3年无病存活率仅为20%～30%[2]。目前中医药治疗肿瘤越来越受到重视，气阴两虚是多数实体瘤患者临床常见的证型， 益气养阴法可抑制肿瘤增殖, 改善体质，降低西医疗法的毒副作用， 提高患者生存质量[3]，但益气养阴方对白血病作用机制不详。本研究初步探讨益气养阴方含药血清对体外白血病细胞的影响。

1 材料

1.1 细胞株与实验动物

实验用白血病HL-60细胞株由山东省医学科学院药物所肿瘤室馈赠。实验动物Wistar大鼠由济宁市鲁康动物饲料经销中心提供(动物合格证号：SCXK鲁20130001)。

1.2 主要仪器与试剂

超净工作台(苏州净化设备厂)；CO2培养箱(HERACELL240型，德国Heraeus公司)；倒置显微镜(TS100- F型，Nikon公司)；12孔和96孔细胞培养板(北京COSTAR公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI-1640培养基(HyClone赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)；MTT：CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 益气养阴方及其水煎液制备

益气养阴方组方：太子参30 g，黄精24 g，麦冬15 g，黄芪30 g，白花蛇舌草30 g，半枝莲30 g，蒲公英30 g，小蓟30 g，生地黄24 g，女贞子24 g，旱莲草18 g，天冬15 g，白术12 g，茯苓12 g和甘草5 g。所用中药饮片均购置于山东建联中药店，经山东中医药大学中药专家鉴定符合实验药物标准。称取上述中药1剂剂量，加入8倍量蒸馏水浸泡1.5 h，快速加热至沸腾，水沸后不断搅拌并持续微沸状态30 min，用纱布过滤，收集滤液，滤渣加1.5倍量水续煎20 min，趁热过滤。合并两次滤液，取滤液置旋转式蒸发仪中，浓缩至一定浓度，即得复方益气养阴方水提取物，4 ℃储存备用。

2.2 益气养阴方含药血清的制备

参照国家自然科学基金重点项目《中药复方体外实验方法学研究》关于“中药含药血清体外实验操作规程”建议草案制备。将Wistar雄性大鼠随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别用生理盐水和0.657 5 g/mL、1.315 g/mL、2.63 g/mL的益气养阴方水煎液灌胃。每日早中晚各1次，每次4 mL，连续4 d灌胃，第5天早上灌药2 h后，乙醚麻醉，于腹主动脉取血。将血液置于无菌离心管中，在无菌状态下，1 500 r/m离心10 min，分离出血清。取上清液，经56 ℃、30 min灭活处理，用0.22 μm微孔滤器进行过滤除菌后，装入无菌小瓶，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 MTT比色法检测HL-60细胞增殖

取对数生长期的HL-60细胞，离心。经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含10%胎牛血清的培养液将细胞终浓度调整为2×105个/mL，并吹打成混悬液。并将此细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每组6个复孔，每孔100 μL。分别加入对照组、低剂量、中剂量、高剂量含药血清的RPMI-1640培养液100 μL ，设置空白调零孔，加入等体积的PBS。在37 ℃，5%CO2孵箱中培养，分别作用24 h后，加入CCK溶液10 μL，将培养板在培养箱内孵育1 h，吸弃孔内培养上清液，终止培养。将培养板置于酶联免疫检测仪，在酶标仪450 nm和570 nm处的波长测定各孔吸光度值(OD)，计算各组HL-60细胞增殖抑制率(IR)。

IR(%) =(1-含药血清组OD值/等浓度的正常血清组OD值)×100%

2.4 Wright-Gimsa染色法检测HL-60细胞形态

取对数生长期的HL-60细胞悬液铺入12孔板，细胞总数1×106个/孔，并设置高剂量组、中剂量组、低剂量组与对照组，分别加入各浓度含药血清并使终体为2 mL/孔。作用48 h后，吸取各孔培养基至离心管，2 000 rpm离心5 min。弃上清，将底层沉淀细胞涂至预处理的载玻片上，将载玻片放入染色液中浸染5 min，然后用蒸馏水冲洗，室温晾干。干燥后于倒置显微镜下观察HL-60细胞形态。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度的含药血清对HL-60细胞增殖的影响

从图1可以看出，低剂量组、中剂量组与高剂量组对HL-60细胞均具有一定程度的抑制作用。中剂量组、高剂量组的HL-60细胞抑制率均高于低剂量组，组间差异有统计学意义(P<0.01)；高剂量组的HL-60细胞抑制率高于中剂量组，组间差异也有统计学意义(P<0.01)。因此，高剂量组的抑制增殖作用最强，细胞抑制率最高。

图1 不同浓度的含药血清对细胞OD值的影响

3.2 益气养阴方对细胞形态的影响

对照组HL-60细胞经含药血清作用48 h之后，倒置显微镜下观察细胞生长良好，细胞形态学无明显变化。低剂量组HL-60细胞形态学略微发生变化，具体表现为极少数细胞核偏于一侧，胞浆稍显增多。中剂量组细胞形态学发现部分细胞的细胞核偏于一侧，胞浆增多，细胞核略显凹陷，细胞形态变化开始显现。高剂量组发现多数细胞的细胞核偏于一侧，胞浆增多，细胞核凹陷分叶明显，细胞形态变化明显，已经到达中晚幼成熟阶段。结果见图2。

图2 益气养阴方对细胞形态的影响(Wright-Gimsa,×1 000)

3 讨论

急性白血病是骨髓或造血组织中原始及幼稚血细胞大量异常急骤增生的恶性疾病，是我国肿瘤病人死亡的主要死因之一[1]。根据发病机制，治疗白血病的重要策略是抑制这些异常的原始细胞和幼稚细胞的过度增殖和诱导其分化成熟。中医学将急性白血病归为“急劳”“虚劳”“血证”“热劳”等范畴，认为其发病机理常为正气虚损与邪毒内侵并举，正邪相争，久病则虚，毒在骨髓、气血津液传变，致使脏腑气血功能受损失调，气血亏耗，内虚为本，病情反复[4]。因此本虚标实是疾病的根本，气阴两虚是该病的特点，尤其在疾病经过化疗后和疾病进展到后期时此特点更为明显。因此治疗应该以益气养阴为主[5-6]，辅助以清热解毒、凉血止血。本实验所用益气养阴组方体现了中医以扶正为主，益气养阴，兼顾祛邪的治疗策略。方中太子参重用，以补气生津，用黄精以滋阴益气，麦冬以养阴生津，使精血化生有源而填精益髓，气旺津生，共同针对气阴两虚的本虚病机，起到主要治疗作用。黄芪助太子参健脾益气而生血，补诸虚之不足。白花蛇舌草、蒲公英与半枝莲合用，契合热毒与瘀血互结的标实病机，有清热解毒、化瘀通络的功效。佐以生地黄填骨髓、清血热、养阴津。旱莲草、女贞子归肝肾经，在补肝肾之阴的前提下，又辅以小蓟行凉血止血之功，白术、茯苓既可健脾益气，又可佐制大剂清热凉血解毒药的苦寒之性，顾护脾胃运化功能，共奏辅助正气，兼顾祛邪之疗效。

既往临床和动物实验研究表明，益气养阴方对白血病患者和模型动物具有较好的治疗作用。有临床研究表明[7]，利用益气养阴方联合西药化疗治疗急性白血病患者，患者血红蛋白、血小板升高而白血病细胞计数降低，同时骨髓造血得到改善，疾病总体缓解率为85.3%，显著优于单纯西医治疗。另有研究者利用益气养阴方灌胃于白血病大鼠模型，发现症因子子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α水平显著下降，并且减轻白血病细胞组织浸润，有利于大鼠恢复[8]。董军等[9]利用益气养阴方观察白血病小鼠的尾尖静脉血细胞形态发现，益气养阴组有核细胞数较模型组明显减少，有核细胞多为成熟的分叶核粒细胞，核呈分叶状，粒细胞颗粒消失，染色质细微，淋巴细胞呈浅灰蓝色，无颗粒，胞浆明显减少，核浆比例明显升高。笔者研究结果从细胞水平上与上述研究结果相一致，初步证实益气养阴方体外在抑制HL-60细胞增殖的同时，诱导细胞分化，增加成熟细胞的比例，尤其是大剂量组，细胞形态变化最明显，已经使白血病细胞到达中晚幼成熟阶段。研究还发现益气养阴方可诱导急性白血病细胞HL-60衰老和使细胞阻滞在G2-M期[10]。

综上，益气养阴方具有抑制白血病细胞增殖及诱导其分化的作用，其具体的分子机制尚需进一步研究，从而在临床上更好的得以应用。