贮藏条件对扁桃仁分离蛋白理化特性及消化特性的影响

王炜清 - 李秀婷 - 周 彬 李述刚 -

(1. 湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2. 北京工商大学食品与健康学院，北京 102488)

扁桃(AmygdaluscommunisL.)又名巴旦木或巴旦仁，是世界上著名的干果树种和木本油料树种[1]。扁桃仁营养丰富，含有大量脂肪、蛋白质、粗纤维、维生素及矿质元素等[2-3]，同时扁桃仁还具有广泛的保健作用，如可降低糖尿病和冠心病等疾病的发生[4-5]。但其高脂肪和高蛋白特性使其在加工过程中易发生品质劣变，如颜色、风味等变化，极大地限制了扁桃仁蛋白质在食品领域的应用。贮藏是产品加工过程中不可避免的一个环节，不同的贮藏条件将直接影响产品品质及货架期。目前，研究者们[6-8]重点探究坚果油在贮藏过程中的变化，忽略了其蛋白质的品质变化。

试验拟以扁桃仁分离蛋白(almond protein isolate，API)为研究对象，以贮藏过程API结构与功能特性为观测指标，重点探究不同贮藏条件对API消化特性的影响，以期为富含脂质和蛋白质的坚果类产品的贮藏与开发利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

扁桃仁：购自新疆莎车县农贸市场；

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸盐(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：优级纯，美国Sigma公司；

二硫苏糖醇(DTT)：分析纯，Aladdin阿拉丁试剂公司；

邻苯二甲醛(OPA)：优级纯，美国Sigma公司；

其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

双光束紫外可见分光光度计：TU-1900型，北京普析通用仪器有限责任公司；

圆二色光谱仪：J-1500型，日本JASCO公司；

电泳仪：DYY-8C型，北京六一有限公司；

荧光分光光度计：F-4600型，日本日立公司；

氨基酸分析仪：L-8900型，日本日立公司；

质谱仪：Q Exactive型，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 扁桃仁去壳烘干后进行真空与非真空包装，置于不同温度(4，25，35 ℃)下贮藏，分别于贮藏第0，1，3，6，9个月取样进行检测。

1.2.2 基本营养成分测定

(1) 水分含量：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。

(2) 蛋白质含量：参照GB 5009.5—2006《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法。

(3) 脂肪含量：参照GB 5009.6—2016《食品中安全国家标准 食品中水分的测定》。

(4) 还原糖含量：参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》。

(5) 灰分含量：参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》。

(6) 氨基酸组成：参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。

1.2.3 扁桃仁蛋白的提取 采用碱溶酸沉法制备扁桃仁分离蛋白(almond protein isolate，API)[9]。将扁桃仁脱皮后进行磨粉、过筛，采用石油醚(30～60 ℃)进行脱脂得到扁桃仁脱脂粉。将脱脂粉溶于超纯水中[1∶30 (g/mL)]并调节pH至9.5，35 ℃搅拌3 h后以8 000×g离心20 min。将上清液pH调至4.5，静置15 min 后在4 ℃ 下8 000×g离心20 min，水洗沉淀2次。将沉淀物分散于超纯水中并调节pH至7.0，并在4 ℃ 下透析3 d，冷冻干燥得蛋白粉。

1.2.4 理化特性测定

(1) 巯基、二硫键的测定：采用Ellman's试剂法[10]。

(2) 羰基价的测定：采用DNPH法[11]。

(3) 表面疏水性的测定：参照Arzeni等[10]的方法，用ANS荧光探针测定蛋白质的表面疏水性(Ho)。

1.2.5 结构特性测定

(1) 二级结构的测定：配制0.2 mg/mL的API溶液于0.1 cm的石英比色皿中，扫描波长为190～250 nm，扫描速率为100 nm/min。

(2) 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳：参照Moritz等[12]的方法，利用SDS-PAGE对蛋白质分子量变化进行分析。浓缩胶与分离胶的浓度分别为4%，12%，电压分别设置为70，100 V。

1.2.6 功能特性测定

(1) 溶解性：根据Qu等[13]的方法，稍作修改。将API溶液(10 mg/mL)在室温下搅拌1 h，以8 000 ×g离心20 min，上清液的蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法测定，按式(1)计算溶解度。

(1)

式中：

S——溶解度，%；

C0——样品中蛋白质含量，mg；

C1——上清液中蛋白质含量，mg。

(2) 起泡特性：参照胡静[14]的方法，利用泡沫分析仪对扁桃蛋白的起泡性能进行测定。样品浓度为10 mg/mL。

1.2.7 消化特性的测定

(1) 消化率：将1 mL胃蛋白酶溶液(40 mg/mL)加入到20 mL样品溶液(10 mg/mL)中，并将混合物的pH调节至2.0。将混合物在37 ℃水浴中于黑暗中振荡3 h。最后，用0.1 mol/L NaHCO3溶液将样品溶液的pH值调节至7.0，以终止反应[15]。采用OPA试剂法[16]测定API在消化过程中水解度变化。

(2) 消化产物分析：肽段的分析使用Dionex 3000 RSLC UHPLC系统串联Q Exactive质谱仪。使用Proteome Discoverer 1.4 (version 1.4, Thermo Fisher Scientific, Palo Alto, CA, USA)匹配肽MS/MS谱；使用标准蛋白数据库(www.uniprot.org, UP000009136)与Sequent搜索算法对数据进行分析；利用Venn图分析多肽的相似性[17]。

1.2.8 数据处理 所有试验均平行3次，采用SPSS 23.0分析软件对数据进行显著性分析，利用Origin 2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 扁桃仁的营养成分分析

由图1可知，扁桃仁富含脂质(53.53%)与蛋白质(21.60%)；扁桃油主要由油酸(C18:1)与亚油酸(C18:2)组成，不饱和脂肪酸含量较高(72.98%)。由表1可知，扁桃仁蛋白质含有18种氨基酸，必需氨基酸种类全、含量充足，且相互比例适当。由此可知，扁桃仁是一种营养组成全面，富含脂质和蛋白质的优质坚果资源。

表1 扁桃仁蛋白质的氨基酸组成

图1 扁桃仁的基本成分及其脂肪酸组成

2.2 贮藏条件对扁桃仁蛋白质理化特性影响

蛋白质分子中的巯基和二硫键对其结构和功能特性均有影响，如蛋白质的凝胶性、界面行为和消化性能等[18]。如图2(a)～(d)所示，不同贮藏条件下API游离巯基和二硫键的含量不同。随着贮藏时间的延长，所有样品的巯基含量均显著降低，对照组(储存0 d)的巯基含量为20.64 μmol/g，而非真空包装于35 ℃贮藏9个月后其巯基含量降低了60.7%。结果表明较高的贮藏温度可导致API的巯基含量显著降低。而贮藏期间，API的二硫键含量变化趋势与巯基相反。随着贮藏时间的延长，二硫键含量从11.32 μmol/g增加到30.21 μmol/g。这可能是贮藏过程中的氧气、光以及脂质氧化会诱导扁桃仁中蛋白质的氧化变性，而蛋白质变性和二硫键的形成都可能导致巯基含量的减少。

蛋白质氧化的另一个重要变化是羰基(包括醛基和酮基)的形成。氨基酸侧链的直接氧化、肽链的裂解、糖的还原或与非蛋白质羰基化合物的结合均可产生羰基[18]。如图2(e)和(f)所示，对照样品的羰基含量为0.11 μmol/g，随着贮藏时间的延长，所有样品的羰基值急剧增加(P<0.05)。另外，相同的贮藏时间下，不同的贮藏温度也会引起羰基值的显著差异，且羰基值与贮藏温度呈正相关。刘宝华等[19]研究大豆分离蛋白质在贮藏期的变化，结果表明随贮藏时间的延长，蛋白质羰基值逐渐增加，与试验的变化趋势相同。

蛋白质分子的表面疏水性可以反映其表面疏水基团的相对含量，是维持蛋白质结构的重要特性[18]。如图2(g)和(h)所示，随着贮藏时间的延长，表面疏水性呈明显的上升趋势。真空包装处理的扁桃仁在35 ℃贮藏9个月后，API表面疏水性变化最为显著，从3 050增加到8 142。这可能是由于：扁桃仁贮藏期间，外部因素会诱导蛋白质氧化，导致其构象发生变化。随着氧化程度的增加，API分子逐渐展开，其内部疏水基团暴露，导致表面疏水性增加。

*表示在0.1水平上显著

2.3 贮藏条件对扁桃仁蛋白质结构特性的影响

2.3.1 二级结构 试验通过蛋白质二级结构的变化考察不同贮藏条件下API的氧化程度。由表2可知，随着贮藏时间的延长，β-折叠和无规则卷曲的含量逐渐增加，而α-螺旋和β-转角的含量降低。非真空条件下(35 ℃)贮藏9个月后，API的α-螺旋含量从31.4%降低到19.1%，β-折叠含量从30.1%增加到43.5%，β-转角含量从12.1%降低到2.5%，无规则卷曲从26.5%增加到34.9%。比较两种包装条件下的贮藏样品，发现在真空包装条件下，API二级结构含量的变化略低于非真空包装组。吴伟等[20]研究发现贮藏过程中大米蛋白质的无序结构逐渐增加，二级结构稳定性逐渐降低。

表2 贮藏期间API二级结构的变化

2.3.2 SDS-PAGE 图3显示了API在不同贮藏条件下的电泳图谱，初始API的分子量主要集中分布在35～40 kDa 和10～15 kDa，随贮藏时间的延长，在15 kDa和35～40 kDa左右的主要蛋白带逐渐消失或消失，而在50～70 kDa的蛋白带则明显增厚；尤其是贮藏超过6个月后，在泳道的顶部出现条带。随着贮藏时间的延长，蛋白质的迁移率逐渐降低，可能是由于过氧自由基蛋白的氧化导致了API分子中的共价交联，形成高分子量聚集体。同时，蛋白质氧化的加深也将导致某些蛋白质分子的降解，从而在低分子量区域产生离散的条带。

1～3. 分别于4，25，35 ℃贮藏的真空包装样品 4～6. 分别于4，25，35 ℃贮藏的非真空包装样品 Mark. 蛋白质标品

2.4 贮藏条件对扁桃仁蛋白质功能特性的影响

如图4(a)和(b)所示，随着贮藏时间的延长，API的溶解度明显降低。非真空包装、35 ℃贮藏9个月后，其溶解度降低了85.3%。贮藏期间API溶解度降低的主要原因有两个：① 贮藏过程中蛋白质氧化导致蛋白质分子之间的交联，形成较大分子量的聚集体，最终导致API溶解度降低；② API的表面疏水性在贮藏过程中增强，并且暴露的疏水基团可能通过疏水性相互作用聚集，导致溶解度降低。何钟瑜等[21]研究发现蛋黄在不同温度下贮藏后，溶解度均发生下降，并认为这可能是蛋白质氧化所致。

如图4(c)～(f)所示，随贮藏时间的延长，API的起泡能力与泡沫半衰期逐渐降低。API起泡特性在贮藏期间发生变化可能是由于随着API氧化程度的加深，不断暴露的疏水基团形成不可溶的聚集体，改变了蛋白质分子的表面张力和气—液界面的稳定性，最终导致其起泡能力与泡沫稳定性显著下降[22]。另外，有研究[23]表明蛋白质氧化会导致其溶解性和结构稳定性下降，进而影响蛋白质的起泡特性，该结果与API分子量、溶解性等变化趋势相符。

*表示在0.1水平上显著

2.5 贮藏条件对扁桃蛋白消化特性的影响

2.5.1 消化率 贮藏引起的蛋白质氧化可能导致一系列氨基酸的丢失和变性，可能导致API及相关产品的营养价值显著下降。因此，通过体外模拟胃消化试验研究了不同贮藏条件处理的API消化特性(图5)，研究发现，不同贮藏条件处理API经胃蛋白酶酶解后，体外消化率表现出显著差异(P<0.05)。3个温度下贮藏9个月后，API的水解度显著降低，而较高的温度导致水解度的降低更为显著。这可能是较高的温度和较长的贮藏时间导致API氧化，形成共价交联的氧化聚集体，掩盖了API胃蛋白酶的作用部位，从而减慢了胃蛋白酶的消化过程并抑制了API的消化。同时，这与蛋白质氧化晚期阶段聚集体的形成有关，一方面抵消了蛋白质结构展开的作用，另一方面，氨基酸的损失也影响了酶促水解的速率。此外，已有研究[24]表明二级结构的含量会影响蛋白质的体外消化率，α-螺旋的含量越高，蛋白质的消化越容易，而β-折叠的含量越高，则抑制蛋白质消化。何莉媛等[25]研究也发现贮藏期间米糠蛋白的消化率随贮藏时间逐渐降低。

图5 贮藏条件对API消化率的影响

2.5.2 消化产物分析 基于MS对API消化产物分子量分析，以进一步评估在不同贮藏条件长期贮藏后扁桃仁的蛋白质消化率的差异。如图6所示，API消化产物的分子量主要集中在3 000 Da以下，贮藏9个月后，API消化产物分子量增大。这也证实了水解度的结果，该水解会抑制API的消化。图7显示了初始样品及分别在4，25，35 ℃真空包装的样品贮藏9个月后经胃蛋白酶处理得到的独有肽段数，分别为9 618，8 851，8 354，8 554，其中有2 147个共有肽段。初始样品与非真空包装在4，25，35 ℃贮藏9个月后的样品，分别具有9 663，9 037，8 888，6 728个独有肽段。此外，非真空包装的扁桃仁于35 ℃贮藏9个月后，API消化产物的肽段数量从13 096急剧减少至8 662，这是由于蛋白质的消化率越高，独有肽段的数量越多，该结果与水解度的结果一致。

图6 不同贮藏条件下的API消化产物的肽指纹图谱

图7 不同贮藏条件下API肽段韦恩图

3 结论

通过探讨扁桃仁分离蛋白在不同贮藏温度、包装方式以及贮藏时间下的理化指标、结构与功能特性、消化特性变化来探究其贮藏特性，结果表明扁桃仁分离蛋白在贮藏期间结构特性发生改变，进而影响其功能特性与消化特性。因此，在扁桃的加工、贮运过程中，应尽量避免扁桃仁蛋白质暴露在剧烈的环境条件中，防止蛋白质品质下降造成资源流失。后续将进一步探究扁桃仁蛋白质在贮藏期间的品质变化规律与机制。