青梗菜速俊109杂交种纯度SSR分子标记鉴定

范伟强，王超楠，黄志银，李 梅，张 红，郑思宇，徐营莉，华德平

(1.天津科润蔬菜研究所,蔬菜种质创新国家重点实验室，天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300381；2.天津师范大学生命科学学院，天津 300387； 3.天津大学生命科学学院, 天津 300072)

青梗菜(BrassicarapaL.SSP. chinensis)，是小白菜的一种，原产于中国，因其具有生长期短、商品性好、方便烹饪、味道鲜美等优点，深受人们喜爱，广泛种植于世界各地。

种子纯度是种子质量的重要指标之一，直接影响品种产量及商品性。种子纯度鉴定方法有很多，长期以来，形态学鉴定是重要的鉴定方法之一，此方法简单、直观，但存在周期长、易受环境影响、表型特征判断不易把握等缺点[1]。同时，由于选育品种数目逐年增多及育种材料来源狭窄的影响，不同品种间的差异越来越小，可供品种鉴定用的特征性状越来越少，经常出现形态学鉴定法难以满足实际应用需要的问题[2]。另外，很多品种还存在严重的休眠问题，更延长了纯度鉴定周期，影响种子及时销售。

近年来，分子标记鉴定方法被广泛应用于种子的纯度鉴定工作中，与形态学鉴定法相比，具有稳定、准确、快速等优点[3]。其中，SSR具有多态性丰富、重复性高、结果稳定可信等优势，是被广泛应用的分子标记之一[4]。目前，SSR分子标记已被成功应用于包括甘蓝型油菜、萝卜、棉花、玉米、水稻、大豆等[5-10]多种作物的种子纯度鉴定中。速俊109是一个优质的青梗菜品种，具备株型直立、叶色绿、光泽度好、早熟高抗、适应性广等特点，得到了市场的认可。但速俊109的种子休眠严重，无法通过形态学及时进行纯度鉴定，本研究以SSR分子标记技术为基础，设计筛选合适的引物，以期为速俊109种子纯度鉴定提供快速、高效的解决方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青梗菜速俊109杂交种及其父本、母本；8份青梗菜速俊109杂交种样品。试验材料均由天津科润蔬菜研究所大白菜研究室提供。

参考白菜基因组序列信息，设计72对SSR引物，使用Primer Premier 5.0软件设计，由华大基因公司合成。

1.2 田间鉴定与DNA提取

供试材料播于试验田，每份约2 000株，常规田间管理。待其长到7～9片真叶时，根据叶形、叶色、株型等形态特征进行纯度调查统计。每份分为2个部分，第1部分为480株，在对应编号畦中顺序调查，不挑选，统计假杂株(父本、母本及其他杂株)数，并取所有材料的心叶于离心管中，用于DNA提取；其余为第2部分，统计假杂株(父本、母本及其他杂株)数与检测总数。

青梗菜速俊109杂交种及其父本、母本采用CTAB法提取DNA；8份青梗菜速俊109杂交种样品采用碱裂解法提取DNA[11]。

注: F1为杂交种;M为DNA markerⅠ;a 1～a 42为F1代杂交种样品。图2 引物扩增结果

表1 分子标记技术鉴定结果与形态学鉴定结果对比

1.3 引物筛选

设计SSR引物72对，在青梗菜速俊109杂交种及其父本、母本之间筛选，筛选出具有多态性的引物。

PCR扩增反应体系：DNA模板2μL，正、反向引物各0.4μL，2×TaqMaster Mix 5μL，灭菌去离子水2.2μL。

PCR反应程序：94 ℃开始预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染，统计结果[12]。

1.4 数据分析

分子鉴定纯度(%)=[(检测株数-母本带型数-父本带型数-其他杂带型)/检测株数]×100%；

田间鉴定纯度(%)=[(检测株数-父本株数-母本株数-其他杂株数)/检测株数]×100%。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

对72对SSR引物在青梗菜速俊109杂交种及其父本、母本间进行筛选，其中QGC-A 07-44引物对在双亲间及F1杂交种间表现出共显性差异，条带清晰、明显，可用于纯度鉴定。引物筛选结果如图1,引物序列如下：

A 07-44-F:5′- ACT AAT TGG CAA TTA GTG GAT TGA CCC AAG-3′

A 07-44-R:5′- ACA AGA TCC TTG GTC CGA CAG AAA C-3′

注:1为父本;2为母本;F1为杂交一代。图1 特异性引物筛选结果

2.2 杂交种纯度SSR鉴定

利用引物QGC-A 07-44对8份青梗菜速俊109杂交种样品进行纯度鉴定，每份取480个样本，典型条带如图2。其中对应的不符合F1带型的条带(包括父本、母本、其他带型)的数量分别为：6、7、4、6、5、8、3、9，计算出纯度分别为：98.75%、98.33%、99.17%、98.75%、98.96%、98.33%、99.37%、98.13%(表1)。

2.3 分子标记技术鉴定结果与形态学鉴定结果对比

利用形态学鉴定法对8份青梗菜速俊109杂交种样品进行田间鉴定。480株部分的假杂株(父本、母本及其他杂株)数量分别为：4、2、1、3、0、1、0、4，对应的纯度结果与分子标记技术鉴定结果相比较，差异分别为：0.83%、1.46%、0.73%、0.94%、1.04%、1.57%、0.63%、1.45%(表1)，偏差≤2%；8份杂交种样品的检测总株数分别为：1 921、1 935、2 032、1 879、1 936、2 126、1 946、2 318，其中假杂株(父本、母本及其他杂株)数总量分别为9、6、4、7、3、4、0、11，对应的纯度结果与分子标记技术鉴定结果相比较，差异分别为：0.78%、1.36%、0.63%、0.88%、0.89%、1.48%、0.63%、1.40%(如表1)，偏差≤2%。

3 结论与讨论

在种子生产过程中，品种多种多样、繁种量巨大往往是现代育种工作中商品种种子纯度鉴定工作的背景，采用形态学鉴定法鉴定种子纯度，周期长且繁琐，同时需要大面积土地和大量农资作为物质基础，还易受天气等外界因素的影响，本研究实现了利用分子标记技术鉴定青梗菜速俊109杂交种的纯度，与形态学鉴定法相比，结果偏差≤2%，符合误差允许范围[13]，解决了通过传统形态学鉴定法鉴定种子纯度时面临的不足，提高了工作效率，保证了种子质量。

本研究中，选取的单个样本检测数量为480，考虑到检测结果的可靠性，以及时间、耗材的成本，最佳检测样本容量需要进一步试验研究[14]。另外，利用分子标记技术鉴定纯度结果略低于利用形态学鉴定的结果，可能是由于基因水平的差异不一定会导致表型性状的差异，需要进一步探索研究。

长远来看，我国种子经营主体数量众多，尽管相关部门对种业市场严格监管，但销售假冒伪劣种子、非法套牌现象时有发生。所以，保证种子货真价实、保护育种者合法权益至关重要，分子检测技术不仅可以检测杂交种的纯度，也可以实现种子真实性的检测，为解决这些问题提供了有效的途径，成熟分子检测体系的建立将促进我国种业的健康发展。