高效液相色谱法检测食品中8种直接染料和6种合成色素

白 洋, 潘 城, 任小英, 胡朝阳, 谢 勇, 黄永辉, 黄何何

(国家加工食品质量监督检验中心(福州),福建省产品质量检验研究院，福建福州 350002)

直接染料即不需媒染剂的帮助便能够染色的染料，主要应用于纤维、棉纺等行业,部分直接染料由于自身的偶氮结构使其具有致癌、致畸等毒副作用，因此在其应用上有着严格的限定，更不允许在食品当中使用。合成色素作为人工合成的产品，具有颜色多样、着色力强的优点，在食品加工行业有着非常广泛的应用，但是在其生产成过程中会带入一定量的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐等有害物质，对人体有着一定的危害。因此根据我国《食品添加剂使用卫生标准》[1],对合成色素的使用有着严格的规定。

随着人们对生态环境以及食品安全的更加重视，染料以及合成色素的使用受到了越来越多的关注。其中由于直接染料已知的致癌致畸性[2 - 4]，近年来出现了大量关于染料的吸附以及降解方面[5 - 13]的研究，而食品中合成色素的使用也备受瞩目[14 - 17]。因此，对于食品中非法添加的染料以及合成色素的检测仍然应该是我们食品安全检测的重点。

目前染料以及色素常见的检测方法有液相色谱法[18 - 21]、毛细管电泳法[22]、液相色谱-质谱法[23 - 26]。其中，质谱法由于检测成本较高，而毛细管电泳法在和紫外检测器联用时灵敏度较低，因此这两种方法在日常筛查中难以普及。而液相色谱法具有较低的检测成本、准确的定量分析以及较高的灵敏度等特点，使其在日常检测中更加具有优势。但是目前针对食品中染料检测的液相色谱法通常只针对一种或少数几种的染料以及色素进行检测，覆盖范围相对较小。本文建立的同时高效、快速测定 8种直接染料直接黄23、直接红28、直接红81、直接蓝6、直接蓝1、直接黑38、直接黄12、直接黄26，以及柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝6种合成色素的分析方法，可以加大食品中非法添加着色剂的监测力度，为食品安全保障提供支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪(美国，Waters公司)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-800KDE高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Avanti J-E高速冷冻离心机(美国，贝克曼公司)；MS 3 basic单发涡旋振荡器(德国，IKA公司)。

直接黑38(Direct black 38，纯度98%)购自百灵威科技有限公司；直接蓝1(Direct blue 1，纯度100%)、直接黄12(Direct yellow 12，纯度100%)、直接黄26(Direct yellow 26，纯度100%)均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；直接蓝6(Direct blue 6，纯度100%)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；直接红23(Direct red 23，纯度99%)购自上海一研生物科技有限公司；直接红28(Direct red 28，纯度98%)购自德国CNW科技公司；直接红81(Direct red 81，纯度98%)购自山东西亚化学工业有限公司；柠檬黄(Tartrazine，浓度0.5 mg/mL)、日落黄(Sunset yellow，浓度0.5 mg/mL)、胭脂红(Ponceau 4R，浓度0.5 mg/mL)、苋菜红(Amaranth，浓度0.5 mg/mL)、亮蓝(Brilliant blue，0.5 mg/mL)、诱惑红(Allura red，1.0 mg/mL)购自中国计量科学研究院；乙腈、甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)。

糖果、红酒、饮料均为市售商品。

1.2 实验条件

1.2.1 标准储备液和标准工作溶液配制准确称取适量的各化合物标准品(精确到0.01 mg)，用50%甲醇溶解并定容至100 mL，配制成浓度为70 mg/L到4 108 mg/L的混合标准品储备液，用50%甲醇稀释成0.035 mg/L到41.1 mg/L之间的系列标准工作溶液，置于冰箱中-4 ℃保存。

1.2.2 样品前处理糖果类固体样品称取1.0 g(精确至0.0001 g)于烧杯中，加入一定量50%甲醇溶解，超声30 min，随后转移至10 mL容量瓶中，待其冷却后定容至刻度线，摇匀，过0.20 μm PTFE滤膜，供高效液相色谱上机分析。红酒、饮料类液体样品直接称取1.0 g(精确至0.0001 g)于10 mL容量瓶中，加入一定量50%甲醇溶解，摇匀，过0.20 μm PTFE滤膜，供高效液相色谱上机分析。

1.2.3 仪器参数条件色谱柱：WondaCract ODS -2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A为乙腈，B为0.02 mol/L NH4Ac溶液；梯度洗脱程序：0～20 min，3%～30%A；20～30 min，30%～38%A；30～35 min，38%～60%A；35～35.1 min，60%～3%A；35.1～40 min，3%A。流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；检测波长：柠檬黄、直接黄12、直接黄26选择400 nm作为检测波长；日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、直接黄23、直接红28、直接红81选择508 nm作为检测波长；亮蓝、直接蓝6、直接蓝1、直接黑38选择613 nm作为检测波长。

图1 8种直接染料和6种合成色素在乙腈-0.02 mol/L乙酸铵溶液体系下色谱图Fig.1 Chromatograms of 8 kinds of direct dyes and 6 kinds of synthetic pigments under acetonitrile-ammonium acetate solutionPeaks:1.Tartrazine;2.Amaranth;3.Ponceau 4R;4.Sunset yellow;5.Allura red;6.Direct blue 6;7.Direct blue 1;8.Brilliant blue;9.Direct red 81;10.Direct red 23;11.Direct red 28;12.Direct yellow 26;13.Direct yellow 12;14.Direct black 38.

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

在实验过程中，使用光电二极管阵列检测器对14种标准样品进行全波长扫描。根据其光谱图并结合各化合物的响应灵敏度，本实验分别选择400 nm作为柠檬黄、直接黄12、直接黄26的检测波长；选择508 nm作为日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、直接黄23、直接红28、直接红81的检测波长；选择613 nm作为亮蓝、直接蓝6、直接蓝1、直接黑38的检测波长。

2.2 流动相体系的选择

实验比较了乙腈-水溶液、乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液两种流动相体系。发现在乙腈-水溶液体系下，8种直接染料和6种合成色素的出峰效果和灵敏度极差；而乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液体系，可以使8种直接染料和6种合成色素均有良好的峰形和分离效果，因而选择乙腈-0.02 mol/L NH4Ac溶液体系进行下一步的实验。图1为8种直接染料和6种合成色素的混合标准溶液的色谱图。

2.3 色谱柱的选择

实验比较了WondaCract ODS -2柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Ultimate XB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)对8种直接染料和6种合成色素的分离效果。当采用Ultimate XB-C18柱时，直接红81和直接红23保留时间几乎一致，无法分离；而采用WondaCract ODS -2柱时，各化合物均有最好的分离效果，因此选用WondaCract ODS -2柱。

2.4 样品前处理的优化

分别考察了甲醇、NH4Ac溶液、50%甲醇作为提取溶剂时对回收率以及化合物响应的影响。发现当甲醇作为提取溶剂时，柠檬黄几乎没有响应；当用NH4Ac和50%甲醇作为提取溶剂时各化合物的回收率均在95%以上，而50%甲醇作为提取溶剂时，直接黑38、直接蓝6、直接蓝1的灵敏度更高，因此选择50%甲醇作为提取溶剂。

2.5 线性方程、线性关系、检出限及定量限

配制系列混合标准溶液，根据相应的峰面积(Y)和对应的检测浓度(X)制作标准曲线，如表1所示。各化合物在他们的浓度范围内具有很好的线性关系，相关系数r大于0.9993，以3倍信噪比(S/N=3)时的质量浓度作为检出限，10倍信噪比(S/N=10)时的质量浓度作为定量限，各化合物的检出限均小于1.1 mg/kg，定量限小于3.2 mg/kg。

表1 8种直接染料和6种合成色素的线性方程、线性范围、线性相关系数(r)、检出限及定量限

2.6 回收率和精密度测定

在优化后的条件下，分别取样品空白基质进行3个水平的加标回收实验，每个水平重复分析6次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。平均加标回收率为93.5%～99.6%，相对标准偏差(RSD)为1.3%～3.9%。表明该色谱分析方法适用于样品中的8种直接染料和6种合成色素的日常分析检测。

表2 空白样品中8种直接染料和6种合成色素平均加标回收率及其相对标准偏差(n=6)

(续表2)

2.7 稳定性考察

取空白基质样品进行3个水平的加标，并放置于室温条件下，分别在0、4、8、12、24、48 h下进行测定，计算3个水平加标的RSD值分别为4.5%、3.9%、4.2%，表明样品溶液在48 h 内具良好稳定性。

2.8 实际样品测定

图2 7号样品色谱图Fig.2 Chromatograms of sample 7

应用此方法对国内市售不同品牌的6种红酒、10种饮料、4种糖果进行了测定。其中1号糖果检出亮蓝15 mg/kg；2号糖果检出日落黄51 mg/kg；3号糖果检出诱惑红9.3 mg/kg；6号饮料检出柠檬黄7.6 mg/kg；7号饮料检出柠檬黄8.2 mg/kg、日落黄15 mg/kg；10号饮料检出亮蓝0.32 mg/kg、柠檬黄5.1 mg/kg；13号饮料检出诱惑红0.87 mg/kg、柠檬黄8.0 mg/kg。所有样品均未检出直接染料，且其合成色素含量均符合标准(GB 2760-2014)的规定。图2为7号样品实际色谱图。

3 结论

本文建立了一种同时测定食品中8种直接染料和6种合成色素的高效液相色谱法。分别考察了不同色谱柱、流动相体系、前处理等因素对待测物分离效果的影响。该方法快速、灵敏度高、准确度高，可用于食品中8种直接染料和6种合成色素的同时分析检测，为食品安全的检测提供技术支持。