基于矿质元素和稳定同位素的马铃薯产地溯源技术

张欣昕，张福金,，刘广华，张 尧，王雪娇，莎 娜，连海飞

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010030；2.鄂尔多斯市环境保护中心监测站，内蒙古 鄂尔多斯 017000）

马铃薯作为世界十大营养食品之一，可以提供人类生活所必需的基本营养素。它富含淀粉、纤维等碳水化合物和优质蛋白质，并且具有较好的氨基酸组成[1]，几乎不含游离脂肪和胆固醇[2]，是良好的、廉价的低脂肪食物来源。因此，马铃薯又有“能源植物”、“地下苹果”、“第二面包”等多种美喻[3]。作为内蒙古主要作物之一的马铃薯，应其得天独厚的天然地理环境，具有优于其他产区的品质特征，是内蒙古特色标志性农产品之一。

目前，国内外基于矿质元素和稳定同位素的产地溯源研究众多：起初多应用于植物源性特色农产品领域，包括葡萄酒[4]、茶叶[5]、水果[6]、小麦[7]、苦荞[8]、花生[9]、大米[10]、中药[11]等。例如：Kelly等[12]利用矿质元素溯源分析技术对美国、欧洲、印度和巴基斯坦4 个国家的稻米进行产地鉴别，发现锰、硼、硒、铅等元素能作为地域特征的重要指纹信息，是有效的溯源指标；Branch等[13]发现δ13C能有效区分加拿大、美国和欧洲不同地域的小麦样品；马奕颜[14]探讨了矿物元素溯源分析技术在猕猴桃产地溯源的有效性，建立了猕猴桃产地溯源的有效指标体系及产地判别模型；张遴等[15]采用稳定同位素质谱技术，对我国陕西、宁夏、山东等11 个省市‘红富士’苹果中δ13C进行测定分析，研究发现‘红富士’苹果中δ13C具有区域独特性和时间稳定性。随着研究技术的发展，其研究领域逐渐扩展到动物性农产品中，肉类（牛羊肉[16-17]）、乳类制品[18]等领域的产地溯源也有了相当广泛的研究。例如Schmidt等[19]对美国和欧洲的牛肉样品中C和N同位素进行研究，结果表明C、N同位素比值可作为区分不同产区牛肉的重要指标。

大量研究表明：基于矿质元素和稳定同位素的溯源分析技术在产地溯源上，溯源指标科学，判别正确率、可信度较高，因此，在借鉴前人完善的采样方法、检测技术以及分析手段的基础上，尝试利用矿质元素和稳定同位素溯源分析技术，通过对不同产区马铃薯矿质元素含量和稳定同位素比值的分析讨论，开展马铃薯产地判别研究，旨在为内蒙古马铃薯产地判别以及地理标志产品保护提供参考与帮助，以期促进内蒙古马铃薯区域品牌的构建与发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8 mm×5 mm锡囊、浓硝酸（优级纯） 德国Meker公司；内标物钪（Sc）、锗（Ge）、铟（In）、铋（Bi）（单元素标准溶液1 000 mg/L） 国家标准物质采购中心；尿素IVA33802174（同位素标准品） 德国Analysentechnik GmbH & Co.KG公司。

1.2 仪器与设备

MARS 6微波消解系统 美国CEM公司；iCAP-TQ电感耦合等离子体质谱仪、DELTA V稳定同位素质谱仪（配Flash EA 1112型元素分析仪） 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集

在2017年和2018年马铃薯收获期，分别采集内蒙古、黑龙江、新疆、四川和广东5 个省区马铃薯主产县市马铃薯生产基地样品，共计100 份，采样地点信息如表1所示。每个采样点随机采集3 个样品。将采集马铃薯去皮后，去离子水洗涤，组织捣碎机匀浆后，取50～100 g，于60 ℃鼓风烘箱干燥2 h后，再用105 ℃烘干至恒质量[20]，充分研磨后，过100 mm目筛，作为分析样品备用。

表1 采样地点统计Table 1 Statistics of sampling locations

1.3.2 样品分析

矿质元素的测定：参考GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》[21]。准确称取马铃薯样品0.5 g（精确至0.001 g）于微波消解管内，加入10 mL浓硝酸，静置1 h，旋紧管盖，采取程序升温法进行样品消解，待消解结束后冷却至室温，用少量水冲洗内盖，真空赶酸，用去离子水定容至50 mL容量瓶内，同时做空白实验。用电感耦合等离子体质谱测定样品中的钠、镁、铝、钾、钙、铁、硼、磷、钒、铬、锰、钴、镍、铜、锌、砷、硒、镉共18 种矿物元素的含量。用外标法定量分析，用环境标样为标准品，用Sc、Ge、In、Bi保证仪器稳定性。电感耦合等离子体质谱运行条件如表2所示。

表2 电感耦合等离子体质谱运行条件Table 2ICP-MS operating conditions

稳定同位素的测定：参照张协光等[22]的方法。称取制备好的样品0.5～1.0 mg包入锡囊，排尽空气，放入元素分析仪的固体进样器依次进样，样品在960 ℃条件下燃烧生成CO2和N2，经稀释仪稀释后进入质谱进行检测。

元素分析仪测定：氦气吹扫流量100 mL/min，参考气流速90 mL/min，气相柱温度70 ℃。

质谱条件：真空度6.0×10-6mbar，电离电压3.0 kV，CO2参考气压0.6 bar，N2参考气压1.0 bar。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 基于矿质元素的产地鉴别

2.1.1 矿质元素含量差异分析

表3 不同地区矿质元素含量Table 3 Mineral elements contents in potato samples collected from different producing regions mg/kg

表4 方差分析结果统计Table 4 Analysis of variance

如表3、4所示，砷和硒的P值分别为0.07和0.095 7，在0.05水平上差异不显著，其他16 种元素含量差异显著（P＜0.05），说明马铃薯中不同矿物元素在不同地区的含量存在显著性差异。

2.1.2 矿质元素含量主成分分析

表5 矿质元素的主成分贡献率Table 5 Contribution rates of principal components for mineral elements

主成分分析是一种将多变量通过降维，找出数据群体主要影响因子的多元统计分析方法[23]。如表5所示，选取特征值大于1的成分作为主成分，提取5 个有效主成分。第1主成分贡献率为33.747%，第2主成分贡献率为15.243%，第3主成分贡献率为9.344%，第4主成分贡献率为6.248%，第5主成分贡献率为5.973%，总贡献率达到了70.557%，5 个主成分基本包括了不同元素含量和组成的大部分信息，可充分反映原始数据大量信息。

根据元素的载荷大小逐步对元素进行筛选，参照鹿保鑫[24]的方法。选择第1主成分和第2主成分的因子载荷值作图，如图1A所示，横坐标代表第1主成分载荷值，纵坐标代表第2主成分载荷值，成分因子载荷值的绝对值取值越大，代表元素的方差贡献率越大，即硼、磷、锰、铬、铜、锌元素载荷值均在0.8左右，在第1主成分上载荷值较大，6 个元素基本可以反映第1主成分的信息；镁、钠、钾、铝元素载荷值的绝对值在0.6～0.7之间，在第2主成分上载荷值较大，这4 个元素基本可以反映第2主成分的信息，说明硼、磷、锰、铬、铜、锌、镁、钠、钾、铝等元素，携带足够的区域特征信息，在很大程度上可以作为马铃薯产地溯源的特征矿质元素。利用第1主成分和第2主成分的因子得分绘制散点图，如图1B所示，内蒙古和新疆、四川、广东、黑龙江5 地样品基本得到有效区分，内蒙古本地样品间也存在距离间隔，说明矿质元素可作为马铃薯产地鉴别的指标，在内蒙古本地样品间的产地鉴别上也同样具有应用的可能性。

图1 不同地区主成分因子载荷图（A）和得分图（B）Fig.1 Loading plot (A) and score plot (B) of PCA for potato samples collected from different producing regions

2.1.3 矿质元素含量判别分析

判别分析是按照一定分类条件，建立判别函数，进行数据样本分类的统计方法[25]。18 种矿物元素作为分析指标，利用Fisher函数，对不同产地马铃薯进行了整体判别。表6分类结果显示：18 种矿质元素初始的整体判别率为98.4%，广东和新疆的马铃薯样品100%被正确识别，内蒙古、四川和黑龙江存在错判样品，数量分别为1、3 份和2 份，内蒙古、四川和黑龙江产地马铃薯样品判别率分别为99.4%、85.7%和90.0%。

并利用Leave-One-Out Cross Validation交叉验证对判别结果进行验证。交叉验证分组案例中，有94.2%的马铃薯样本被正确分类，其中四川、黑龙江和新疆的马铃薯样本正确判别率分别为71.4%、50.0%和81.8%，低于整体水平。

表6 不同地区矿质元素的判别分析分类结果Table 6 Discriminant analysis of mineral elements in potato samples collected from different producing regions%

在实际产地判别中，不可能同时测定18 种矿质元素，时间成本和经济成本较高。为了提高实际应用的效率，需要进一步筛选有效信息，减少变量，通过改变变量的处理方式，利用逐步判别对不同地区马铃薯样品进行产地溯源。分析结果显示，在0.01显著水平下，有8 种元素进入判别模型，8 种元素分别为钠、铝、磷、锰、钴、镍、铜、镉，回代检验结果显示8 种元素交叉验证的正确判别率为89.3%，判别率略低于18 种元素的判别效果，但实际效率相对较高，由钠、铝、磷、锰、钴、镍、铜、镉8 种元素所建立的判别函数系数如表7所示。

表7 判别式分类函数系数Table 7 Discriminant classification function coefficients

研究发现，主成分分析和判别分析方法都能对内蒙古、新疆、四川、广东、黑龙江5 地的马铃薯样品进行准确鉴别，2 种方法均证明钠、铝、磷、锰和铜元素在马铃薯产地溯源中具有良好的产地指纹特征，但判别正确率未达到95%以上。

2.2 基于同位素比值的产地鉴别

2.2.1 同位素比值差异

表8 不同地区δ13C和δ15N值Table 8 δ13C and δ15N values of potato samples collected from different producing regions

如表8所示，不同地区的δ13C值范围在-22.47‰～-38.55‰之间，δ15N值的范围在-1.91‰～3.08‰之间，内蒙古与黑龙江、新疆、广东的δ13C值和δ15N值分别存在显著性差异（P＜0.05），说明内蒙古马铃薯中的δ13C值和δ15N值与其他地区间有明显的分离趋势。

研究表明[26]：同一物种的δ13C值差异受生长地的气候环境（如温度、海拔、降水等）的影响，而δ15N组成受植物类型、化学肥料、气候条件、土壤状况等因素的影响。刘贤赵等[27]研究年降水400 mm等值线上自东北向西南沿途采集的28 个科118 种239 份C3植物样品，发现所有样本δ13C与温度之间呈极显著线性正相关（P＜0.000 1），随年均温度和夏季平均温度的增加，植物碳同位素均呈偏正的趋势；李嘉竹等[28]研究发现2 000 m以上高海拔区323 个C3植物样品δ13C值与海拔高度存在极显著的线性正相关（r=0.496，P＜0.000 1）；而2 000 m以下低海拔地区C3植物δ13C值与海拔呈负相关，与温度呈正相关。高登义等[29]也有相似的研究结果。另外，植物的水分利用也是影响δ13C值的关键因素，任书杰等[30]研究发现随水分利用率的下降，δ13C值显著升高，二者间表现出极显著负相关。这些研究结果与本实验的δ13C值和δ15N值在一定程度上具有一致性的规律。

另外，采样调研显示：北方的黑龙江和内蒙古马铃薯生产均采用规模化喷灌和滴灌方式，灌水充足；南方马铃薯生产基本集中在山坡地区，以小农户生产方式为主，基本不具备灌水设备。新疆的马铃薯生产主要集中在农牧交错带，农业生产多采用放牧与种植作物混合经营，因此δ15N值较高，这与Suzuki等[31]的研究一致，该研究发现新南威尔士州大米具有更高δ15N值（9.0‰），明显区别于加利福尼亚（3.2‰）和日本大米（0.4‰～6.1‰）。

因此，以δ13C值为横坐标，δ15N值为纵坐标作二维投射图，如图2所示，内蒙古样品与黑龙江、新疆、广东和四川样品基本可以成功区分，说明这5 地的δ13C值和δ15N值的组成差异较大，与方差分析结果一致。

图2 不同地区的δ13C值和δ15N值Fig.2 δ13C versus δ15N plot for potato samples collected fromdifferent producing regions

2.2.2 同位素比值的聚类分析

聚类分析是将数据中具有相似性的数据进行归类划分的统计方法[32]。对不同地区样品中的δ13C值和δ15N值进行聚类分析，采用Ward聚类方法计算欧氏距离，产生聚类分析树状图，结果如图3所示。以最小分类级别（1.7）为分割线，所有样品可以分为10 类，其中内蒙古与黑龙江、新疆和广东距离较远，被完全分离，其δ13C值和δ15N值的组成差异较大，内蒙古与四川样品存在交叉现象、黑龙江和新疆样品存在交叉现象。同时也发现，内蒙古本地区样品也被划分为5 类，内蒙古不同地区在其δ13C值和δ15N值的组成上也存在较大差异，证明了δ13C值和δ15N值的组成也可应用于内蒙古不同马铃薯产地的鉴别研究。

图3 不同地区的δ13C值和δ15N值聚类分析Fig.3 Cluster analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N

2.2.3 同位素比值的判别分析

为了将δ13C值和δ15N值转化为可通过函数计算，并能获得产地判别精度，再一次应用判别分析的方法对不同地区的δ13C值和δ15N值进行分析。利用Fisher函数，获得5 个判别函数，利用判别函数进行不同产地样品判别，如表9所示。初始判别率为82.0%，其中内蒙古和黑龙江的产地初始判别准确率分别为82.6%和77.8%，低于平均水平，可能需要利用矿质元素的指纹特性进一步提升产地鉴别的精度。

表9 不同地区判别分析分类结果Table 9 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on δ13C and δ15N%

2.3 基于矿质元素和同位素比值的产地判别

针对8 种矿质元素含量和同位素比值分别在产地判别正确率均未达到95%以上的问题，进一步研究2 种方法相结合的产地判别方法。

基于钠、铝、磷、锰、钴、镍、铜、镉、δ13C和δ15N值，再次对内蒙古与黑龙江、新疆、四川和广东不同产地马铃薯进行产地判别，结果如表10所示。在矿质元素含量和同位素比值综合指标下，对初始分组案例中94.7%进行正确分类，即不同产地的初始判别正确率为94.7%，对交叉验证分组案例中93.2%进行了正确分类，即不同产地的交叉验证正确率达93.2%，高于矿质元素含量和同位素比值单独判别正确率，判别结果良好。

表10 基于矿质元素和稳定同位素的不同地区判别分析分类结果Table 10 Discriminant analysis of potato samples collected from different producing regions based on mineral elements and stable isotopes%

3 结 论

本研究分别对内蒙古与黑龙江、新疆、四川和广东不同产地马铃薯样品进行矿质元素含量和组成、碳和氮同位素比值进行测定。采用步进式方法筛选出钠、铝、磷、锰、钴、镍、铜、镉8 种矿质指纹指标，回代检验结果显示这8 种元素的交叉验证的正确判别率为89.3%；不同地区的δ13C值和δ15N值存在显著性差异，内蒙古样品与黑龙江、新疆、广东样品基本可以成功区分，采用δ13C和δ15N建立的产地判别模型的判别正确率为82.0%；在钠、铝、磷、锰、钴、镍、铜、镉、δ13C和δ15N的综合指标下，不同产地的初始判别正确率达94.7%，不同产地的交叉验证正确率达93.2%，高于矿质元素含量和同位素比值单独判别正确率，判别结果良好。结果证明利用矿物元素和稳定同位素相结合的技术可以对马铃薯进行有效的产地判别，判别正确率较高，是产地溯源的有效方法。