继代培养中马尾松生根能力及其与内源激素含量的相关分析*

王 胤 姚瑞玲

(广西林业科学研究院 南宁 530002)

马尾松(Pinusmassoniana)是我国亚热带地区特有的脂材两用乡土造林树种，综合利用价值高、推广前景广阔，不仅可用于生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用作生产松香、松节油等工业原料(杨章旗等， 2011)。广西林业科学研究院多年来一直从事马尾松良种选育方面的工作，先后选育了‘宁明桐棉’、‘忻城古蓬’、‘容县浪水’等速生、优质、高产优良种源11个。其中，宁明桐棉种源(桐棉松)在全国17个省(区)的马尾松全分布地理种源试验中表现优异，通过了国家良种审定，是我国最为优良的马尾松地理种源之一。桐棉松干形通直、皮薄、生长快、产量高，是马尾松骨干育种资源(杨章旗等， 2011)。然而，马尾松种源、家系遗传分化差异较大，人工林生产力普遍不高，严重制约了马尾松产业的快速发展(杨模华等， 2011)。通过无性快繁技术进行无性系育林，是实现马尾松人工林集约高效定向培育的重要途径。受扦插母株生理年龄效应的影响(季孔庶等，1996)，利用组织培养技术，加快马尾松优良无性系繁育与利用。

松属(Pinus)植物由于松脂分泌代谢旺盛、萌蘖能力差及生理年龄效应显著等问题，组培属世界性难题(杨模华等， 2011； 伊书亮等， 2013； Jainetal.， 2005； Yaoetal.， 2016)。目前，国内外有关松树成年植株离体再生培养成功方面的报道仍鲜少见。在马尾松茎芽离体培养前期研究中，发现外植体幼化是获取茎芽离体培养成功的关键(Wangetal.， 2019)。利用嫁接等系列诱导复幼措施，建立了一套马尾松成年植株茎芽离体培养技术(Wangetal.， 2017)，实现了马尾松规模化组培育苗。

继代培养是进行外植体驯化，提升繁殖效率，实现大规模组培苗生产的前提与保障。然而，大量研究表明，在植物长期继代培养中，营养体出现退化，生长势差，再生繁殖能力减弱(苏秀城， 2000； 李淑艳等， 2008； 刘玲梅等， 2008)。自2014年以来，笔者先后建立了257个马尾松基因型无菌繁殖体系，持续观察发现，经继代15～20次(1.5～2年)后，继代芽繁殖效率高，生根效果稳定，而继代时间达4年左右时，继代芽生根困难，生根率、根条数明显下降，植株再生效率低，阻碍了马尾松无性系育苗工厂化。如何解决长期继代培养造成繁殖效率低(生根能力弱)这一技术瓶颈，探讨继代培养过程中马尾松不定根发育的关键影响因子尤为重要。以往研究表明，继代数与植物激素是导致继代培养中植株再生效率变化差异较大的重要因素(苏秀城， 2000； 师校欣等， 2007； Huangetal.， 2007)。鉴于此，本文以桐棉松同一基因型不同继代数继代芽为研究对象，研究长期连续继代培养中马尾松继代芽生根能力与内源激素水平的变化，分析内源激素与生根能力的相关性，为揭示马尾松生根机制，建立高效马尾松无性育苗技术体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以优良马尾松地理种源桐棉松为研究对象，采用5株优势木法，在广西国有派阳山林场15～30年生桐棉松优良林分中选优。以入选优树当年新抽嫩枝为穗条，半年生马尾松组培苗为砧木，按常规方法嫁接。嫁接成活后，去掉嫁接苗顶梢，用500 mg·L-1GA3每隔1周喷施植株促芽萌发，连续喷施3～4次。待嫁接苗萌条长至1 cm时，以0.5%尿素每周喷施1次，至萌芽条达3～5 cm长时，于春季晴好天气采下活力旺盛萌芽条为外植体进行茎芽离体培养。外植体消毒、始芽诱导与继代培养依照Wang等(2017)方法进行。根据建立的不同基因型无菌繁殖体系的继代芽增殖系数与生根率，以外植体来源母树年龄为26年，繁殖效果最稳定的基因型GLM-8为试验对象，继代周期35～40天，以连续继代培养1～40代继代芽为供试材料。

1.2 继代芽生根能力观察

2014—2018年，先后以继代1、3、5、8、10、15、20、30、40次的继代芽为试验材料，根据Wang等(2017)方法，培养基中附加1.2 μmol·L-1萘乙酸(naphthaleneacetic acid，NAA)进行继代芽不定根诱导。每继代数来源接种30瓶，每瓶接种4～6株，重复接种试验5次。生根诱导35天后，待不定根肉眼可见时，统计不同继代数继代芽的生根率和长度≥5 mm的不定根数目。其中： 生根率(%)=(生根苗株数÷接种单芽总数)×100，根条数=生根单芽不定根数目总和÷生根苗株数。

1.3 继代芽内源激素含量测定

测定时间及试验材料同1.2。激素含量参照Wang等(2019)方法进行测定。

1.4 外源生长调节剂对继代芽生根诱导处理

试验包括3个步骤： 1) 1～40代不同继代芽生根能力与内源激素相关性分析； 2) 以继代1代(35～40天)、20代(700～800天)、40代(1 400～1 600天)继代芽为材料，培养基中添加1.2 μmol·L-1NAA为对照(Control)，1～16 μmol·L-1IAA或多效唑(paclobutrazol，PAC)为试验处理，观察继代芽生根能力变化； 3) 以继代40代继代芽为材料，培养基中添加4 μmol·L-1IAA+4 μmol·L-1PAC为处理，以1.2 μmol·L-1NAA为对照，观察马尾松生根能力变化。步骤2)、3)中各继代数每处理接种30瓶，每瓶接种4～6株，重复5次。

1.5 数据分析

利用单因素方差分析(one-way ANOVA，α=0.05)对不同继代数、激素处理间的均值进行差异显著性检验； 利用线性回归法分析不同内源激素(IAA、GAs、ABA、ZR)与生根能力(生根率、根条数)的相关关系。为检验经长期继代后马尾松继代芽生根能力在对照(NAA)和IAA+PAC处理间是否存在显著变化，利用T-test(α=0.05和0.01)进行差异显著性分析。数据处理采用SPSS 19.0统计分析软件，用Excel软件绘图。

2 结果与分析

2.1 继代数对继代芽生根能力的影响

根据前期研究基础，以26年生桐棉松优良林分中入选优势木为繁殖材料，经外植体消毒、始芽诱导、继代增殖和不定根诱导培养后，筛选继代增殖能力强(增殖系数5.0～6.7)、生根效果稳定(>90%)的基因型GLM-8为研究对象，分别将继代1～40代的继代芽接种到1.2 μmol·L-1NAA的生根培养基中，处理35天后对肉眼可见的生根苗及不定根数进行统计(图1)。

图1 继代数对马尾松继代芽生根能力影响

继代数对马尾松继代芽生根率和根条数影响显著。继代时间≤700～800天时，随着继代数增加，生根率和根条数逐渐增加，在继代数为15～20代时，继代芽的生根率和根条数最大； 当继代时间>800天时，继代芽生根能力明显下降，其中在继代1 400～1 600天时，继代40代继代芽的生根率(65.7%)和根条数(0.5)最低，与20代继代芽相比，分别下降了33.4%和92.8%。这说明，一定继代时间(1.5～2年)范围内，马尾松继代芽生根能力随着继代数增加而增强，而后随着继代时间延长马尾松继代芽生根能力衰退。

2.2 继代数对继代芽内源激素水平的影响

图2 继代数对马尾松继代芽中内源激素水平的影响

继代过程中，不同继代数间继代芽内源激素IAA、GAs、ZR和ABA含量均差异显著(P<0.05)(图2)。随着继代数增加，各内源激素水平呈不同变化趋势。其中，IAA先上升后下降，峰值出现在15～20代； GAs在1～20代无明显变化，30代开始显著增加，在40代达最高值； ZR呈逐渐上升趋势，40代时含量最高； ABA水平在1代时最高，之后开始下降，继代数≥8时，ABA含量无明显变化。以上结果表明，马尾松继代芽中内源激素水平与继代数密切相关。

2.3 继代芽内源激素水平与其生根能力相关性分析

线性回归分析表明，继代过程中继代芽内源IAA、GAs、ZR和ABA水平与生根率、不定根条数的线性关系不显著(R2∶0.01～0.58)。但从线性相关系数大小来看，IAA、GAs与生根能力间相关性大于ZR和ABA。鉴于激素间的互作与协同性，在进一步相关性分析中发现，IAA/GAs的比值与生根率(R2=0.90)、根条数(R2=0.89)呈显著正相关的线性关系(图3)，这一结果表明高浓度IAA、低浓度GAs继代芽易于生根，低浓度IAA和高浓度GAs具有生根抑制性。

图3 马尾松继代芽生根能力与内源IAA/GAs比值相关性分析

2.4 外源IAA和PAC对继代芽生根的影响

为揭示IAA与GAs在马尾松不定根形成中的作用，根据继代过程中内源激素水平及与生根能力相关性分析结果，选择生根率、根条数和内源激素水平差异显著的继代数(1代： 35～40天； 20代： 700～800天； 40代： 1 400～1 600天)，进行不同浓度外源性IAA或PAC(GA生物合成抑制剂)处理下继代芽生根能力差异分析。

表1 外源IAA和PAC对不同继代时间马尾松继代芽生根能力的影响①

由表1可知，继代时间(继代数)不同，IAA和PAC对马尾松继代芽生根的影响也不同。与对照1.2 μmol·L-1NAA处理相比： 继代35～40天时，4 μmol·L-1IAA显著提升继代芽的生根率和根条数，而PAC随着浓度增加，对继代芽生能力抑制性增强； 继代700～800天时，IAA和PAC均对生根率和根条数产生抑制性，且浓度越高，抑制性越强； 继代1 400～1 600天时，低浓度IAA对生根率的作用不明显，4 μmol·L-1IAA提高了生根率，但IAA浓度为≥8 μmol·L-1时，对生根率具有抑制性，而IAA对根条数具有明显的促进性，且随着浓度增加而增强。对PAC而言，浓度为4 μmol·L-1时，显著改善了40代继代芽的生根能力，生根率和根条数分别较对照增加了40.3%和205.3%。由图4可知，培养中同时添加4 μmol·L-1的IAA和PAC时，继代40代后马尾松继代芽的生根情况。与对照(NAA)相比，IAA+PAC处理下生根率和根条数分别增加49.3%和406.7%。

图4 不同外源生长调节剂处理下马尾松长期继代芽的生根能力差异

上述研究结果表明，继代时间影响继代芽生根能力与内源激素水平，而不同生根能力继代芽对外源生长调节剂促根效果的响应也不同。1) 对生根能力中等继代芽 (继代35～40天)， IAA作用效果优于NAA和PAC。IAA对继代芽不定根形成具有促进性，且随着IAA浓度增加不定根条数越多，但高浓度IAA对不定根发生具有一定抑制性。PAC表现出明显的抑制性，且浓度越高，继代芽生根能力显著下降。2) 对生根能力强继代芽 (继代700～800天)： 以NAA作用效果最佳，IAA和PAC均表现出生根抑制性，且浓度越高，抑制作用越明显。3) 对生根能力弱继代芽 (继代1 400～1 600天)： 与NAA相比，IAA主要促进不定根形成，PAC促进了不定根发生，而高浓度IAA和PAC分别抑制了不定根发生与形成。利用IAA与PAC交互作用，外源IAA+PAC显著提升了继代1 400～1 600天继代芽的生根能力，其效果明显优于外源IAA或PAC单独试验处理。因此，根据不同内源IAA和GAs水平，建议采用不同生长调节剂，即： 内源IAA、GA水平较低时，以IAA作为生根剂； 内源IAA水平高、GA低，用NAA较为合适； 内源IAA中等，而GA较高时，以IAA+PAC效果最佳。

3 讨论

继代培养时间是影响植株再生能力的一个重要原因。在植物组培继代培养会产生“驯化”现象，植株的繁殖效率和生根能力增加，但随着继代时间延长，继代培养物出现衰退，表现出生长不良、再生能力下降，甚至丧失形态发生能力(刘玲梅等， 2008)。崔德才等(2003)认为，继代20次后，培养物再生能力下降70%～80%。然而，不同植物由于保持分化潜力的时间不同，差异变化较长。如葡萄(Vitisvinifera)离体培养64代(6年)后，增殖能力未减弱(周万海等， 2004)。但杉木(Cunninghamialanceolata)(苏秀城， 2000)、毛叶枣(Ziziphusmauritiana)(续九如等， 2003)、棉花(Gossypiumhirsutum)(薛美凤等， 2002)等大部分植物，长期性继代培养后，植株生根率下降，繁殖能力衰退。本研究马尾松继代40次(4年)后，生根能力大幅下降，这与崔德才等(2003)、苏秀城(2000)等研究结论相同。一般而言，继代时间在1年以上视为长期继代(Graneretal.， 2019)。因此，马尾松成年植株茎芽继代培养应按长期继代培养考虑，而为获得高效、稳定的繁殖效果，在马尾松组培育苗中针对不同培养材料，需进行继代培养时间(继代周期、次数)的调整与优化。

激素是植物生长和发育的重要调节因子，在不定根发育中起到关键性作用(Huangetal.， 2007； Fukakietal.， 2009)。从本试验继代芽中内源激素(IAA、GA、ZR和ABA)与生根能力的相关性(R2值)来看，IAA和GA对马尾松生根的影响较大。应用外源生长调节剂调控内源IAA、GA水平，分析继代芽生根率和根条数的变化，能较好反映IAA和GA在马尾松不定根形成中的作用。外源IAA能显著增加植株中IAA含量(周宇飞等， 2017； Zhaoetal.， 2019)。本研究中，经外源IAA处理，再生能力衰退严重的继代40次的继代芽而言，IAA并没有显著改善不定根的发生效果，反而在高浓度(8～16 μmol·L-1)作用下其生根率显著下降。但IAA却促进不定根形成，在4～16 μmol·L-1IAA处理下，根条数大幅增加，较对照(1.2 μmol·L-1NAA)增加了5倍左右。该结果与以往研究揭示生长素在根系形成中的促进性作用结论一致(Marhavetal.， 2011； Canoetal.， 2018)。为观察GA在不定根发育中的作用，本试验采用在生根培养中添加了一种被广泛使用的GA生物合成抑制剂多效唑(PAC)的方法(Watson， 2004； Kamranetal.， 2018)。在4 μmol·L-1PAC作用下，继代40次继代芽的生根率和根条数均增加了，这表明GA在马尾松不定根发育中的抑制性。然而，高浓度(8～16 μmol·L-1)PAC却导致了继代40次继代芽根条数的减少，则表明GA对不定根形成具有一定促进性。以上结果说明，GA在马尾松不定根发育中可能起到促进和(或)抑制性的作用。

GA作用取决于与激素间的交互串扰行为(Mauriatetal.， 2014； Fonouni-Fardeetal.， 2017； Lietal.， 2018)。在本试验继代过程中，继代芽内源激素IAA、ABA、GAs或ZR与生根能力(生根率、根条数)间相关性均不明显，但IAA/GAs比值与继代芽生根能力间呈显著正相关线性关系(R2=0.89～0.90)，说明内源IAA与GA间的平衡调控着马尾松不定根发育。生长素(IAA)作为植物离体再生核心激素，所有其他激素对不定根发育的影响均与IAA有着极大关联性(Fukakietal.， 2009； Galavotti， 2013)。从IAA与GA间交互作用来看，Fu等(2003)认为，芽苗中GA通过对IAA调节的响应促进了不定根发生。本研究中，继代35～800天时，内源GA水平较低的继代芽在高浓度PAC作用下，不定根条数显著减少，说明GA在IAA促进根系形成的作用中具有加效性。而对生根能力差异显著的继代20和30次的继代芽，内源IAA水平无明显变化，但GA水平显著上升。初步推测在内源IAA水平相对较高时，GA对不定根发育主要表现为抑制性。在植物不定根发生中，一般认为GA对IAA具有增效性，能促进根系的伸长与表达，具有生根促进性。而钮世辉等(2013)和Mauriat等(2014)认为，在植物不定根原始体诱导分化期，GA通过影响IAA的极性运输抑制不定根的发生与径向生长，具有生根抑制性。本试验研究结果进一步证实，GA在植物不定根形成中的作用确实存在双重性，且其作用的具体特性与内源生长素(IAA)水平密切相关。

NAA作为一种类生长素，促根作用强，被广泛应用于植物组培育苗中。在以往马尾松组培研究中，NAA对幼态繁殖材料的促根作用强，生根效果稳定(姚瑞玲等， 2016)，但对成熟繁殖材料的促根效果较差(Wangetal.， 2017)。由于繁殖材料生理年龄不同，马尾松生根能力差异显著(季孔庶等，1996； Wangetal.， 2019)，说明生根能力不同的繁殖材料对生长调节剂促根效果的响应可能也不同。本研究以NAA作为对照，生根能力差异显著的同一基因型继代芽为试验材料，证实继代芽生根能力不同，在不同生根剂(NAA、IAA、PAC)处理下继代芽生根效果也完全不同。以往研究，马尾松不定根发生采用的生根剂类型有NAA、IAA、IBA、ABT(30% IAA、20% NAA)等，其生根效果变化较大(黄健秋等，1994； 姚瑞玲等， 2016； Wangetal., 2017)，这可能与繁殖材料和生根剂类型的匹配度不高有关。马尾松不定根形成困难，为提高马尾松生根稳定性，根据不同繁殖材料的生理年龄(生长势)、内源激素水平等特性，应选择合适的生长调节剂。此外，本研究针对生长势减弱、生根能力衰退的长期继代芽，首次采用PAC作为外源性促根剂，取得了较好的生根效果，这对今后开展马尾松高效无性育苗技术体系的构建提供参考。

4 结论

本研究分析了马尾松成年优株茎芽长期继代培养中，继代芽生根能力、内源激素水平变化及两者间相关关系。结果表明，继代培养时间不同继代芽生根能力也不同，长期继代培养导致生根能力衰退。继代培养中继代芽内源激素水平变化差异较大，其中内源生长素与赤霉素的比值与生根能力密切相关，两者平衡调控着不定根的发生与形成。因此，根据继代芽中不同内源生长素与赤霉素水平，应考虑选择不同的外源生长调节剂。