多杀菌素与碳酸铵复合微球的制备及其对沙棘绕实蝇成虫的防治效果*

程态明 李彦艳 魏建荣 苏 智

(1. 河北大学生命科学学院 保定 071002； 2. 中国林业科学研究院沙漠林业实验中心 磴口 015200)

21世纪以来，全球每年约有200万t农药制剂用于防治病虫害(Ghormadeetal.， 2011)，然而农药制剂中有效成分的利用率常常不足30%(Wangetal.， 2018)。我国每年都会出现约10万人因为农药使用不当而中毒的情况，且中毒后的致死率也非常高(董美林， 2011)。如何通过提高农药的利用率从而降低其施用量，是目前国内外研究的热点之一。农药微胶囊化技术，即通过形成微球或微胶囊使活性成分与外部介质分离，从而获得具有控释性质产品的方法(Zhangetal.， 2013)，此类产品可以有效防止药物成分的过快降解、快速挥发或浸出损失，能起到持续控制药物释放的作用(Takeietal.， 2008)，具有很大应用价值。

生物农药的主要优势在于其污染小、低残留、环境兼容性好和病虫害不易产生抗性等(袁善奎等， 2018)。多杀菌素是放线菌刺糖多孢菌(Saccharoplysporaspinosa) 经过有氧发酵所产生的一种大环内酯化合物(苏建亚等， 2003)，土壤光降解半衰期为9～10天，无光照时土壤光降解半衰期为9～17天(杜顺堂等， 2005)，因此在环境中分解较快、毒性较低(Thompsonetal.， 2000)。毒理学研究表明，多杀菌素能破坏害虫中枢神经系统的位点烟碱型乙酰胆碱受体和γ-氨基丁酸受体(Bakeretal.， 1992； Narahashietal.， 2002)，可引起受体结构的改变，产生异常神经冲动，以致肌肉收缩，导致昆虫最终瘫痪或死亡(Salgadoetal.， 1998)，能有效控制鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘翅目和直翅目等多种类型的农林业害虫(李姮等， 2003)。

沙棘绕实蝇(Rhagoletisbatavaobseuriosa)(RBO)，属双翅目(Diptera) 实蝇科(Tephritidae)，是沙棘(Hippophaerhamnoides) 的蛀果害虫，1年1代。成虫将卵产在未成熟的沙棘果果皮下，幼虫孵化后蛀食果肉，导致果实干瘪形成空果，老熟幼虫钻出果皮后掉落在土壤中化蛹(赵斌等， 2017)。在内蒙古磴口县大暴发时致使沙棘果实减产90%以上(魏建荣等， 2012)，在陕西、山西、黑龙江、河北、辽宁和新疆部分地区偶有危害(葛葆蔚等，1988； 范仁俊等，1994； 徐永昶等，1995； 贾艳梅等，1998； 柳玉红等， 2008)。近年来，沙棘绕实蝇在比利时、德国、芬兰、瑞典、白俄罗斯、瑞士和俄罗斯等地也有危害的报道(Stalažsetal.， 2014； Tóthetal.， 2016)。早在1987年，葛葆蔚等(1988)就对沙棘绕实蝇开展了生物学习性和化学防治的初步研究。2014年以来，本实验室从十几种化合物中筛选沙棘绕实蝇的引诱剂，发现碳酸铵对沙棘绕实蝇成虫表现出较强的引诱力(Zhaoetal.， 2018)。由于单一的引诱剂和农药控制沙棘绕实蝇有一定的局限性，如引诱剂持效时间短、化合物易分解等，笔者考虑以微球化对农药和引诱剂进行处理，即将农药和引诱剂包裹进微球内部，使微球既具有引诱又有致死害虫的作用，且达到药物缓释的效果，延长其在田间的作用时间，从而达到有效防治沙棘绕实蝇的目的，并降低控制沙棘绕实蝇的成本。

溶剂挥发法是一种广泛应用于医药的微胶囊或微球制备方法，具有反应条件温和，无特殊反应试剂等多种优点(冯建国等， 2011)。本研究首先通过溶剂挥发法(solvent evaporation method) 中的W/O/W(water-in-oil-in-water) 乳化法制备得到得到多杀菌素/碳酸铵的复合微球，然后测定其理化性质，并对微球的引诱和杀虫效果进行了室内和林间试验测评。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 质量分数为95%的多杀菌素原药(陶氏益农)。 明胶、Tween-60、Span-60、聚乳酸(PLA，NatureWorks公司，分析纯)。 氯化钠、二氯甲烷、碳酸铵(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)， DT-135工业消泡剂(许氏化工科技有限公司)， 甲醇、乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)。

傅里叶红外变换光谱仪Nicolet iS10(赛默飞世尔)； 高效液相色谱仪(日本日立有限公司)； BT-9300H激光粒度扫描仪(丹东市百特仪器有限公司)； OLB9870全自动凯氏定氮仪(济南鑫贝西生物技术有限公司)； 台式电子扫描显微镜(Phenom-World飞纳电镜，荷兰)； 手持式氨气检测仪AR8500(希玛仪器)。

1.2 供试虫源 2017年5月，在中国林业科学研究院沙漠林业实验中心(内蒙古磴口) 第三实验场沙棘林地采集沙棘绕实蝇蛹。将蛹置于23 ℃ ± 5 ℃和RH 50%± 5%条件下，待其羽化为成虫，用人工饲料(蔗糖与蛋白质质量比=3∶1)和水进行喂养。羽化1天后的成虫作为试验材料。

1.3 多杀菌素/碳酸铵微球的制备 将2 g碳酸铵溶解在2 mL蒸馏水中，配置成碳酸铵水溶液，作为内水相； 将2 g PLA加入到20 mL二氯甲烷中，振荡使其完全溶解，然后加入1 g多杀菌素，溶解，作为中油相，然后向多杀菌素的油相中加入碳酸铵水溶液，高速均质乳化(5 000 r·min-1，2 min)，形成初乳液(O/W)； 外水相是将2 g明胶和0.5 g氯化钠加入到200 mL蒸馏水中，在恒温45 ℃水浴中搅拌至溶解，加入0.6 g Span-60和0.4 mL Tween-60作为乳化剂。当外水相明胶水溶液降至室温时，将上述初乳液倒入其中，并加入DT-135约2～3滴和Span-60约3～5滴，将其均质化(3 000 r·min-1，5 min)，形成复乳液(W/O/W)。上述复乳液以700 r·min-1、40 ℃持续搅拌3 h以上，直至二氯甲烷蒸发完毕。过滤、离心并收集固体，干燥后得到制备好的微球。

采用单因素试验设计，比较不同含量碳酸铵对微球理化性质的影响。以碳酸铵作为变量(0.5、1.0、1.5和2.0 g)，同时固定另外4种因素的量： 多杀菌素1.0 g，聚乳酸2.0 g，明胶2.0 g，反应温度40 ℃，制备4种含不同碳酸铵量的微球(用B1—B4分别表示0.5、1.0、1.5和2.0 g碳酸铵制备的微球)。以不含碳酸铵和多杀菌素的空白微球作为对照。制备每种含量微球设3次重复。

1.4 红外光谱测试 对于多杀菌素和碳酸铵是否成功包封，采用红外光谱仪检测。将150 mg的KBr与1 mg微球混合、研磨，然后压制成圆形样品。比较载药微球和空白微球的红外光谱，根据特异谱峰判定供试样品中是否存在该化合物。

1.5 微球中化合物含量的测定 1) 多杀菌素载药量和包封率的测定 微球中多杀菌素的含量采用高效液相色谱法(HPLC) 测定(张苑等， 2003)。条件： 采用色谱柱Ameyst C18-H(4.6 mm×250 mm，5 μm)； 流动相采用甲醇-乙腈-水(体积比=45∶45∶10)，内含0.05%乙酸钠； 流速1.0 mL·min-1； 进样20 μL； 检测波长为250 nm； 柱温为室温。

(1)

理论载药量=

(2)

(3)

2) 微球中碳酸铵含量的测定 先用凯氏定氮仪测量微球样品中氮的质量分数，再计算微球中的碳酸铵包载量(每克微球中碳酸铵的含量)(李宏梁等， 2012)。取干燥的500 mL 凯氏定氮烧杯，将0.5 g微球粉末放入，然后加入硫酸铜-硫酸钾混合试剂5 g以及浓硫酸8 mL。将烧杯置于400 ℃进行硝化，使碳化颗粒完全消失。液体变为浅绿色后继续加热10 min左右。硝化后的样品溶液置于全自动凯氏定氮仪中，检测氮的含量。

1.6 多杀菌素和碳酸铵从微球中的释放测定 1) 多杀菌素 采用透析袋法测量化合物的释放速率(Asraretal.， 2004)。具体步骤： 室温下将500 mg微球置于透析袋中，然后将透析袋浸入含有500 mL缓释介质(甲醇和水体积比为1∶1)的烧杯中。每天取缓释液1 mL(取样后立即加入1 mL缓释介质)，通过1.5.1节的色谱条件测量化合物的释放量。以未包埋多杀菌素作为对照。

2) 碳酸铵 取10 g微球，置于25 ℃、无风条件下，使用氨检测器(灵敏度10 μg·g-1)每天测量氨气的释放量(距离样品10 cm处)，直至监测值为0。以未包埋碳酸铵作为对照。

1.7 微球的形态特征 1) 微球形态 将微球干燥后粘附到导电胶条上，然后贴附于圆形样品台上。采用电子扫描显微镜以5 kV的加速电压观察微球形态。

2) 微球的粒径大小 将0.2 g焦磷酸钠和0.5 g微球加入到100 mL蒸馏水中，超声处理3～5 min后，采用循环分散注入法，利用激光粒度分析仪，测量微球粒度。其中跨度(Span) 表示微球分布的均匀程度，值越小分布越均匀。

1.8 室内外毒杀和林间引诱试验 1) 毒杀试验 方法1： 在饲养盒(聚乙烯，18.5 cm × 11.5 cm × 7 cm)里放入3个玻璃皿(Ф=5.5 cm)，分别加入1 g人工饲料、一团沾2 mL蒸馏水的棉花和1 g微球粉末，并在饲养盒内接入雌雄实蝇各5头。每小时观察记录1次实蝇的死亡数量。在1.3制备试验中，用B1—B4分别表示0.5、1.0、1.5和2.0 g碳酸铵制备的微球，因此按B1—B4共设置4个试验组，另外设蒸馏水作为对照组，每组重复10次。

方法2： 将自制的纱网笼(1 m × 1 m × 1 m)置于沙棘林中，相距5 m，每笼内吊挂500 g新鲜沙棘枝条，用1 g微球配制成的20 mL水溶液喷洒在沙棘枝上。每个笼子里引入30头实蝇(15头雄性，15头雌性)。每小时记录1次实蝇的死亡数量，直到所有成虫死亡。同1.8.1，按B1—B4配置的微球水溶液，共设4个试验组，蒸馏水作为对照组。每个处理3次重复。

2) 林间引诱试验 将1 g微球均匀地洒在黄色粘虫板(25 cm×20 cm，双面含有粘虫胶，北京中捷四方生物科技有限公司)两侧，于6月底将黄板悬挂在沙棘林中，高度1.5 m，黄板间隔3 m，每组悬挂5个黄板。每天更换新的黄板，并统计实蝇的诱捕量，连续10天。共设4个试验组(分别涂有B1-B4的黄板)，无药剂黄板作为对照组，每组重复10次。

1.9 无人机施药防治试验 于沙棘绕实蝇成虫期(7月中旬)，将试验地分成4块180 m × 60 m的样地，每块样地分成4个试验组，1个对照组，每组之间相隔30 m。按照微球和蒸馏水质量比1∶100的比例配制微球溶液。采用无人机进行施药。无人机的喷幅宽为3 m，来回1次的宽度为6 m，每组喷雾面积为6 m×60 m(宽×长)，每组需喷洒7 L微球溶液。在每组试验地悬挂5块黄板(25 cm×20 cm)，高度1.5 m，每个黄板间距为10 m。每天记录黄板诱捕实蝇的数量，并更换新的黄板。15天后，按平行线法在每组试验地中选择3棵沙棘树，并在每棵树上取1个分枝(枝条的长度在1 m以上，果实数量不低于200个)，统计沙棘果实受害率。

1.10 统计分析 对1.8节中的观察时间、实蝇总数和实蝇死亡数3个因子，通过SPSS中的概率回归计LT50值(半数致死时间)。将所得数据采用单因素方差分析(ANOVA) 进行分析，Duncan法比较各变量间的差异显著性。分析前，使用Levene’s法确定原始数据是否符合正态分布，对1.8中的数据和1.9中的诱捕虫数进行平方根转换。果实受害率数据(1.9中) 则通过反正弦转化。所有分析均使用SPSS 20.0软件进行。试验数据以“平均值±标准误”表示，图表中不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

图1 微球的红外光谱

2.2 微球中化合物含量 1) 多杀菌素的包封率和载药量 如图2所示，多杀菌素的加入量不变，但随着碳酸铵量的增加，微球多杀菌素的载药量和包封率都出现了先增大后减小的趋势，其中使用1.5 g碳酸铵时(B3) 出现较大的载药量(32.44%±1.11%) 和包封率(98.34%±1.81%)。但4种微球之间的载药量(F=1.239； df=3, 8；P=0.358)和包封率(F=1.643，df=3, 8，P=0.255)均没有差异显著性。

图2 4种微球中多杀菌素的载药量和包封率

2) 碳酸铵的载药量分析 如图3所示，碳酸铵的载药量呈现出先增大后减小的趋势。当使用1.5 g碳酸铵(B3) 时得到的微球中碳酸铵的含量较大，但没有表现出差异显著性(F=0.998； df=3, 8；P=0.442)。

图3 4种微球中碳酸铵含量

2.3 多杀菌素和碳酸铵的缓释性能 1) 多杀菌素的释放特性 如图4所示，纯多杀菌素持续释放时间7天左右，微球中的多杀菌素持续释放时间15天左右，缓释效果明显。纯多杀菌素的累积释放率在第1天为总量的36.41%，在4～5天内释放率高达约80%。第1天4种载药微球中的多杀菌素的累积释放率均小于20%，10天左右累积释放率才达到80%左右。4种微球中多杀菌素的释放率并没有受到各自实际封药量的影响。

图4 4种微球中多杀菌素和纯多杀菌素的释放曲线

2) 碳酸铵的释放特性 如图5所示，纯碳酸铵的累积释放率在第1天为总量的41.01%，在4天内释放率达到80%左右。4种载药微球的累积释放率在第1天都在总量的30%以下，B1释放量稍大，B3稍小。在持续释放时间方面，纯碳酸铵释放历期为5～6天，4种载药微球中B3的缓释历期为12～14天，其余3种为10～11天。

2.4 微球的形态 如图6所示，通过W/O/W方法制备的微球呈球形、分散状。如图7所示，4种微球的跨度都小于1，说明微球的大小较为均匀，平均粒径都在60 μm左右。其中使用1.0 g碳酸铵时(B2) 所制得的微球粒径较大，但与其他微球相比差异不显著(F=2.279，df=3, 8，P=0.156)。

图5 纯碳酸铵和4种微球中碳酸铵的释放率

图6 微球的形态

2.5 微球的毒力和引诱效果 1) 毒杀作用 当采用方法1时，如表1所示，对照的LT50值最大(79.84 h± 8.94 h)，且和4种微球之间的LT50存在显著性差异(F=325.383； df=4, 45；P<0.05)，表明4种微球对沙棘绕实蝇有毒杀效果。但4组微球间的LT50值没有显著性差异(F=0.288； df=3, 36；P=0.834)，可能是在4种微球中加入相同含量的多杀菌素所致。

方法2中，对照的LT50值最大(117.62 ± 9.22 h)(表2)，且与4种微球之间的LT50存在显著性差异(F=81.886； df=4, 10；P<0.05)，表明4种微球对沙棘绕实蝇有毒杀效果。但4组处理的LT50值没有显著性差异(F=0.726； df=3, 8；P=0.565)。

表1 4种微球对沙棘绕实蝇成虫的致死中时(方法1)①

表2 4种微球对沙棘绕实蝇成虫的致死中时(方法2)

图7 微球的中位径和跨度

2) 引诱作用 如图8所示，4种载药微球与对照之间的沙棘绕实蝇诱捕量存在显著性差异(F=6.627； df=4, 45；P<0.05)，表明载药微球对沙棘绕实蝇表现出较好的引诱效果。其中B3引诱效果最强，但4种微球的诱捕量之间没有显著性差异(F=1.182； df=3, 36；P=0.33)。

图8 不同微球对沙棘绕实蝇的引诱效果

2.6 无人机施药防治效果 如图9所示，无人机施药防治样地的沙棘绕实蝇虫口密度明显低于对照样地，4种微球喷施过的样地与对照样地相比具有显著性差异(F=337.106； df=4, 20；P<0.05)，说明载药微球对沙棘绕实蝇有良好的诱杀效果。B2处理样地的诱捕量大于其他三者，且有显著性差异(F=109.161； df=3, 16；P<0.05)，说明B2处理的样地还有较多的实蝇。15天后，4种载药微球喷洒样地中的沙棘果实受害率显著低于对照(F=88.741； df=4, 10；P<0.05)，说明4种微球对沙棘绕实蝇均有较好的防治效果。其中B3处理样地的果实受害率较低，但4种微球之间没有显著性差异(F=0.774； df=3, 8；P=0.541)。

图9 采用无人机喷施微球对沙棘绕实蝇的防治效果

3 讨论

本研究以明胶和聚乳酸为载体，采用溶剂挥发法，成功制备出含引诱剂和杀虫剂的缓释微球。其中，用于引诱沙棘绕实蝇的碳酸铵是水溶性化合物，而多杀菌素是一种易于包埋的脂溶性化合物，所以笔者将碳酸铵作为内水相，以多杀菌素作为中油相，通过W/O/W复乳法提高了包封率。随着碳酸铵包埋量的增加，微球表面的微孔数量也增加，这可能是由于随着碳酸铵的增加产生的氨气和二氧化碳也在增加。微球表面上的微孔有利于释放微球内的活性物质(华乃震， 2010)，但也可能会缩短产品的存贮期，本试验室将进一步开展试验以弥补这一缺陷。

缓释检测结果表明，微球中的碳酸铵和多杀菌素释放期均被延长。初始阶段(0～5天) 的微球活性成分有较快的释放，表现出“突释效应”(Jégatetal.， 2000； Parketal.， 2005)。因此，微球的释放期可分为2个阶段： 突然释放和持续释放(王娅等， 2017)。将来如何继续提高化合物的包封率、降低“突释效应”、延长化合物释放时间，必须考虑芯材和壁材的理化性质，以及两者之间的比例等，从而达到化合物的均匀释放(Freitasetal.， 2000； 唐辉等， 2002)。

毒杀试验表明复合微球能够杀灭沙棘绕实蝇成虫。沙棘绕实蝇成虫在接触和摄入微球后不会立即死亡是由多杀菌素的理化性质决定，其作用机制是干扰昆虫的神经生理活动进而使昆虫瘫痪逐渐死亡，因此是一个相对缓慢的过程。引诱试验结果中(2.5.2中)，试验组的黄板上每天捕获的沙棘绕实蝇成虫数量是对照黄板的8～12倍，并且其引诱力可以持续7天左右，说明含有引诱剂的微球达到持续引诱害虫的效果，而纯碳酸铵在林间的引诱效果只能持续2天左右。

在林间无人机防治试验中，施药后的试验样地中沙棘绕实蝇的虫口密度明显低于对照组。15天后，试验样地中沙棘果实的受害率也比对照样地中的受害率低，表明微球对于沙棘绕实蝇有较好的防治效果。由于试验样地中的沙棘果实受害率仍在20%左右，说明该项防治技术仍需改进，其中包括继续提高农药和引诱剂的包封率，以及改进无人机的喷施技术。同时，应兼顾生物防治和物理防治等其他防治方法，共同将沙棘绕实蝇的危害控制在经济允许水平之下。

将化学农药和引诱剂组合的“Attract-and-Kill”理念，长期以来一直受到植物保护学界的关注(Pelzetal.， 2005； Chuangetal.， 2008)。然而，实际应用却极为少见。将引诱剂和农药制作成微球应用于害虫防治的报道更为少见。此外，本研究中的缓释系统所使用芯材和壁材以及成品的形态特征和应用方法等方面，均有别于美国研发的控制果实蝇的产品GF-120(Yeeetal.， 2005； Vayssieresetal.， 2009)。本研究中将农药与引诱剂相结合的方法，对于已鉴定出有效引诱剂的农林害虫防治具有很好的借鉴作用。

4 结论

本文所制备的多杀菌素/碳酸铵缓释微球，通过延长引诱剂和生物农药的释放期，达到持续释放的效果，从而减少了农药的使用量和施药次数。可用于林间防治沙棘绕实蝇及其他绕实蝇属的害虫。