高脂饮食诱导高脂血症大鼠及不同器官病理变化

刘 超,何卫保,朱桐林,刘粮泽,高鑫芯,高慧婕

(济宁医学院 药学院, 山东 日照 276826)

近年来，随着我国人民生活水平的逐渐提高，我国居民的食用油年消费量已经达到24.8 kg，平均每天摄入量约为68 g，已经超过推荐用量的2倍[1-2]。高脂、高能量食物的摄入比例增加，血脂异常人群的总体患病率呈快速上升趋势，主要表现为高脂血症[3]。众所周知，心血管疾病是导致全球人口死亡率上升的重要原因，而高脂血症是引发心血管疾病的首要危险因素[4-7]。程序性死亡受体1 (Programmed cell death protein 1 ，PD-1)是一种重要的免疫抑制分子。PD-1与其配体PD-L1主要通过协同刺激作用抑制T 细胞的活化与增殖，下调免疫应答。近年来PD-1被认为与移植排斥、自身免疫性疾病、慢病毒感染、肿瘤免疫逃逸等多种疾病密切相关[8-10]。若阻断PD-1与PD-L1信号途径，自身反应性T细胞的负性调控信号缺失，从而致自身反应性T细胞克隆增殖，从而可引发自身免疫炎症反应。现已知高脂血症与免疫炎症反应密切相关，而有关PD-1与高脂血症关系的研究，国内外均未见报道。本实验通过高脂饮食诱导高脂血症大鼠，探讨PD-1在高脂血症大鼠体内的表达变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

40只清洁级雄性SD大鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号为SCXK(鲁)2014-0007，6周龄，体重160～180 g。

1.1.2 试剂

4%多聚甲醛通用性组织固定液，Biosharp公司；Total RNA Extractor(Trizol)，上海生工生物工程公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司；总胆固醇(T-CHO)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.3 仪器与设备

Filter Max型多功能酶标仪，美国美谷分子仪器有限公司； T100TMThermal Cycler PCR仪、CFX96TMOptics Module荧光定量PCR仪，美国伯乐生命医学产品有限公司；MIX-1500型微孔板振荡仪，杭州米欧仪器有限公司；可调速旋涡混匀器，苏州珀西瓦尔实验设备有限公司；HW.SY11-K型电热恒温水浴箱，北京长风仪器仪表公司；RM2235切片机，德国莱卡。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物处理

将40只雄性SD大鼠适应性喂养1周(温度保持在20～25℃，湿度维持在50%～55%，每天给普通饲料少量多次，保证昼夜交替均12 h)后，测量大鼠体重并随机分为高脂饲料组和普通饲料组各20只。每日早、中、晚分3次给予饲料，普通饲料组每只大鼠日均给料25 g，高脂饲料组每只大鼠日均给料20 g，共计饲养12周[11-13]。普通饲料配方：面粉25%，麦片25%，玉米面25%，豆面10%，鱼粉8%，骨粉4%，酵母粉2%，精盐1%。高脂饲料配方：普通饲料47.7%，猪油15%，蛋白粉12%，全脂奶粉8%，白砂糖8%，胆固醇7%，胆盐0.3%，食盐2%[8]。

大鼠饲养12周后，禁食12 h，逐一称重。腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠。大鼠采血，测定血糖后静置10 min， 2 500 r/min 离心10 min，分离获得大鼠血清，放置在-80℃保存待用。然后解剖大鼠分离肝脏、脾脏和胰腺。选择每只大鼠的部分肝脏，使用4%的多聚甲醛进行固定，剩余脏器迅速分装至冷冻管中，置入-80℃保存。

1.2.2 大鼠肝脏指数、脾脏指数和胰腺指数的测定

大鼠解剖后，分离的肝脏、脾脏和胰腺，使用生理盐水冲洗表面残留血液，吸水纸吸干残余液体后，用精密天平称重，按下式计算脏器指数。

肝脏(脾脏、胰腺) 指数=肝脏(脾脏、胰腺)质量/大鼠体重×100%

1.2.3 大鼠血清TG、T-CHO、 LDL-C和HDL-C含量的测定

将分离的大鼠血清从-80℃冰箱取出，按照试剂盒说明书进行操作，加样后的酶标板放入酶标仪中，测定各孔吸光度。按照给定的公式计算各生化指标的含量。

1.2.4 RT-qPCR法检测大鼠肝脏、脾脏和胰腺PD-1 mRNA的表达

Trizol法提取大鼠肝脏、脾脏和胰腺组织的总RNA，逆转录为cDNA。使用SYBR Green在CFX96扩增仪上进行荧光定量PCR。 PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 大鼠肝脏HE染色

大鼠肝脏组织石蜡包埋，切片机连续切片，厚度5～6 μm，在60℃温水中用载玻片进行粘片，高温烤片90 min，随后脱蜡水化、苏木精-伊红染色，全景扫描仪扫描观察。

1.2.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 大鼠体重和脏器质量的变化(见表2)

表2 大鼠体重和各脏器质量(n=20)

实验过程中，大鼠均未出现死亡，活动度与摄食情况均未见异常。适应性喂养1周(饲喂高脂饲料之前)，普通饲料组与高脂饲料组大鼠体重无明显差异(p>0.05)。由表2可知，饲养12周后，高脂饲料组大鼠体重显著高于普通饲料组(p<0.05)。与普通饲料组相比，高脂饲料组大鼠的肝脏指数、脾脏指数和胰腺指数显著增加(p<0.05)。提示高脂血症可能造成了大鼠各脏器的免疫炎症反应，尤以胰腺指数增加最为显著。

2.2 大鼠血糖和血清TG、T-CHO、LDL-C和 HDL-C的变化(见表3)

表3 大鼠生化指标(n=20)

由表3可知，与普通饲料组相比， 高脂饲料组大鼠的血糖和血清中TG、T-CHO、 LDL-C含量均显著高于普通饲料组(p<0.05)，高脂饲料组LDL-C/HDL-C的比值也显著高于普通饲料组(p<0.05)，证明此次高脂饮食诱导的高脂血症大鼠造模成功。

普通饲料组 高脂饲料组图1 大鼠肝脏HE染色

2.3 大鼠肝脏HE染色(见图1)

由图1可知：HE染色后，镜下观察可见普通饲料组大鼠肝脏组织结构正常，染色均匀分布，细胞排列整齐、清晰，细胞核处于细胞中央；高脂饲料组大鼠肝脏组织发生了脂肪变性，出现了大小不等的脂肪空泡，细胞核被挤压于细胞一侧。

2.4 大鼠肝脏、脾脏和胰腺组织中PD-1 mRNA的表达(见图2)

由图2可知，与普通饲料组相比，高脂饲料组大鼠的肝脏、脾脏及胰腺组织内PD-1 mRNA的表达均呈现下降趋势，差异具有统计学意义(p<0.05)。

注：*表示与普通饲料组比较p<0.05。图2 大鼠肝脏、脾脏和胰腺组织中PD-1 mRNA的表达

2.5 讨论

高脂血症是引发脑卒中、心肌梗死、心源性猝死等心脑血管疾病的危险因素，对身体的损害是隐匿、进行性和全身性的，最终可引发动脉粥样硬化、肾功能衰竭等[6-7]。大量研究表明， 肥胖、高脂高糖饮食、过度饮酒等都是促成高脂血症患病率逐年升高、患病年轻化的危险因素[14]。实验使用高脂饲料诱导高脂血症大鼠，高脂饮食12周后，大鼠血清中TG、T-CHO、LDL-C含量及LDL-C/HDL-C的比值均显著高于普通饲料组， HE染色也显示高脂饲料组大鼠肝脏组织发生了脂肪变性，说明长期高脂饮食可诱导大鼠高脂血症的发生。

机体的高脂血症状态必然对机体的免疫系统产生一系列影响，而高脂血症与免疫炎症反应是密切相关的。有研究发现，人体血清中胆固醇的升高会引起白细胞及单核细胞计数增加，同时高胆固醇血症可以促进中性粒细胞的分化和血小板计数的增加[15-16]。血脂升高能够导致 T细胞亚群比例的变化[17-19]，血脂升高可引发CD8+T 细胞与 CD4+T 细胞的比值升高，而介导免疫抑制作用的调节性 T 细胞(Treg细胞)减少，创造了一个适合于免疫激活的环境。PD-1/PD-L1是表达于T细胞表面的重要免疫抑制分子，PD-1/PD-L1的激活使得Treg细胞转化，致使免疫功能下降；而阻断PD-1/PD-L1通路，可使CD8+T细胞的活性升高，增强机体免疫力[20-21]。有研究发现，PD-L1在组织纤维化水平较高的地方和具有炎症效应的患者中表达较高，PD-L1表达量和肝脏的纤维化程度和炎症效应的强弱呈正相关性，PD-L1高表达有可能诱导机体长时间维持免疫耐受的状态，对肝组织的纤维化进展产生促进效果[22]。实验结果显示，在高脂血症大鼠体内，其肝脏、脾脏及胰腺内PD-1的表达均较正常大鼠显著降低。因此，推测高脂血症大鼠体内PD-1的表达降低，PD-1/PD-L1通路处于抑制状态，提高了机体CD8+T细胞的活性，从而使机体处于免疫激活的状态，引发炎症，参与了高脂血症的发生、发展。后续将展开进一步研究，观察高脂血症大鼠体内免疫系统以及炎症与PD-1表达变化的相关性，进一步探讨PD-1对高脂血症的调节机制。

3 结 论

实验结果表明高脂血症大鼠模型制备成功：高脂饲料组大鼠的肝脏、脾脏和胰腺指数显著高于普通饲料组；高脂饲料组大鼠的血糖和血清中的TG、T-CHO、LDL-C含量以及LDL-C/HDL-C的比值均显著高于普通饲料组；HE染色显示高脂饲料组大鼠肝脏组织内均出现明显脂肪空泡。高脂、高能量食物的摄入比例增加，是促成高脂血症的危险因素。另外，与普通饲料组相比，高脂饲料组大鼠的肝脏、胰腺和脾脏组织内PD-1 mRNA的表达均显著降低，提示PD-1可能参与了高脂血症的发生和发展。