蓬蒿籽多酚提取工艺的响应面优化及其对食用油脂抗氧化活性研究

何福林，黄丽佳，游周敏，梁 珍，邵金华

(湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199)

蓬蒿(Chrysanthemumcoronarium)，菊科蓬蒿属，为一年生或两年生草本植物[1]。蓬蒿在我国已经有900多年的栽培历史，是南、北方人都比较喜爱食用的一种蔬菜[2]。现代研究表明，蓬蒿具有抗肿瘤、止咳祛痰、植物化感作用、杀虫、护肝、抗氧化和杀菌等多种生物活性[3]。蓬蒿籽质地坚硬，多数情况下被当作废弃物丢弃，造成资源浪费[4]。多酚在植物的果实、根、叶以及皮中大量存在，不但能清除自由基、抑制氧化酶活性以及螯合金属离子来抑制油脂氧化[5]，还能间接提高人体内源性抗氧化酶的抗氧化活性[6]。

氧化是食用油脂酸败的主要原因之一，油脂氧化过程中氢过氧化物不稳定，分解产生醛、酮、酸等物质[7]，这些物质既对油脂的风味、色泽、质量有影响，还会产生一些有毒物质，参与各种疾病的代谢途径，导致神经性疾病、癌症、人体老化及冠心病的发生[8]。防止油脂氧化最有效的方式就是添加抗氧化剂[9]。目前，广泛使用人工合成抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ等，但其存在安全隐患，过量使用会致畸、产生慢性病及癌变等[10]。天然抗氧化剂绿色环保，安全性高，受到人们青睐[11]。植物多酚属于天然的抗氧化剂，既安全又能减缓油脂的氧化[12]。目前，国内外从植物中提取多酚的研究报道很多，但关于蓬蒿籽多酚的研究未见报道。本文采用响应面法优化蓬蒿籽多酚的提取工艺，采用Schaal烘箱法研究蓬蒿籽多酚对不同油脂的抗氧化能力，以期为蓬蒿籽多酚的开发和利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

菜籽油、花生油，由永州市冷水滩区中良榨油厂现榨；猪油，实验室自制。蓬蒿籽，市售。碳酸钠、硫酸亚铁、乙酸钠、冰醋酸、没食子酸等均为分析纯。BHA、BHT，南京百慕达生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

F-008S超声波清洗机，深圳福洋科技集团有限公司；Agilent Cary 60紫外可见分光光度计，安捷伦科技(中国)有限公司；GL124-1SCN电子分析天平，赛多利斯(上海)贸易有限公司；PTHW-500普通恒温电热套，南京科尔仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将蓬蒿籽放入40℃干燥箱内烘干至恒重，粉碎过60目筛，用12倍石油醚浸泡24 h脱脂，抽滤后滤渣于50℃烘干，密封保存备用。

1.2.2 蓬蒿籽多酚的提取

准确称取1.0 g脱脂蓬蒿籽粉，在一定的温度、料液比下用不同体积分数的乙醇提取一定时间后，用四层纱布过滤，真空抽滤收集滤液，真空浓缩后60℃真空干燥得蓬蒿籽多酚。

1.2.3 蓬蒿籽多酚得率的测定

1.2.3.1 多酚含量的测定

准确称取没食子酸70 mg，少量蒸馏水溶解后用容量瓶定容至100 mL，得到质量浓度为0.7 mg/mL的没食子酸标准溶液[13]。分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL没食子酸标准溶液，用50 mL容量瓶定容，配成不同质量浓度的标准工作溶液。分别取不同质量浓度的标准工作液1.0 mL至10.0 mL比色管中，再向每个比色管中加入福林酚试剂1.5 mL，充分摇匀30 s后加入6.0 mL 10%Na2CO3溶液，摇匀，加蒸馏水定容，在30℃避光放置2 h进行显色反应,以不含没食子酸的比色管作为空白，在760 nm(由3 mL显色后的没食子酸标准工作溶液和蓬蒿籽多酚样品溶液在400～900 nm下扫描确定的最大吸收波长)处测吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程为y=0.038x-0.005 1，R2=0.998 6。

精密量取1.0 mL蓬蒿籽提取液(1.2.2中真空抽滤后的滤液)于10 mL比色管中，向其中加入1.5 mL福林酚试剂，充分摇匀30 s后加入6.0 mL 10%Na2CO3溶液，摇匀，加蒸馏水定容，在30℃避光放置2 h进行显色反应，以不加蓬蒿籽提取液的作为空白，在760 nm处测吸光度。再根据标准曲线方程，求出提取液中多酚含量。

1.2.3.2 多酚得率的计算

式中：C为蓬蒿籽提取液中多酚含量，mg/mL；V为提取液的体积，mL；N为稀释倍数；m为蓬蒿籽粉质量，g。

1.2.4 蓬蒿籽多酚对油脂的抗氧化效果测定

1.2.4.1 蓬蒿籽多酚对不同油脂抗氧化效果的影响

取猪油、菜籽油、花生油各50 g，向其中添加0.02%的蓬蒿籽多酚，混匀，放入(60±2)℃的烘箱中，每隔8 h摇匀并交换它们在烘箱中的位置，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 d取样测定过氧化值(POV)，每次测定重复3次。

1.2.4.2 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂抗氧化活性比较

取等量的猪油样品各50 g，分别添加0.02%的蓬蒿籽多酚、BHT、BHA、柠檬酸、抗坏血酸,混匀，同时以不加抗氧化剂的猪油为空白对照，然后按1.2.4.1操作，测定油样在加速氧化条件下的过氧化值。

1.2.4.3 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂的协同作用对猪油的抗氧化效果

取等量的猪油样品各50 g，分别添加0.02%蓬蒿籽多酚与0.02%BHT、0.02%BHA、0.02%柠檬酸、0.02%抗坏血酸4种复配物，以及0.04%的蓬蒿籽多酚，混匀，同时以不加抗氧化剂的猪油为空白对照，再按1.2.4.1操作，测定油样在加速氧化条件下的过氧化值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 提取温度对蓬蒿籽多酚得率的影响

在料液比1∶20、乙醇体积分数60%、提取时间55 min条件下，考察提取温度对蓬蒿籽多酚得率的影响，结果见图1。

注：不同小写字母表示差异显著，P<0.05。下同。图1 提取温度对蓬蒿籽多酚得率的影响

由图1可知，随着提取温度的升高，蓬蒿籽多酚得率逐渐增加，当提取温度为70℃时，蓬蒿籽多酚得率最高，继续升高提取温度，其得率降低。这是因为随着提取温度的升高，多酚物质运动加剧，在乙醇中扩散速度越快，提取效果越好，但提取温度过高会破坏蓬蒿籽中的活性成分，而且会增加杂质溶出量，降低多酚溶出量，使蓬蒿籽多酚得率下降[14]。

2.1.2 料液比对蓬蒿籽多酚得率的影响

在乙醇体积分数60%、提取时间55 min、提取温度70℃条件下，考察料液比对蓬蒿籽多酚得率的影响，结果见图2。

图2 料液比对蓬蒿籽多酚得率的影响

由图2可知，当料液比在1∶25时，蓬蒿籽多酚得率达到最大，说明料液比越高，可溶性物质溶出越多，可以提高蓬蒿籽多酚得率[15]。当料液比超过1∶25 后，蓬蒿籽多酚得率变化不大且有下降趋势，这是因为当料液比过高时，可溶性物质溶出已达到最大，增加溶剂反而促进其他杂质溶出，增加了后续浓缩的难度[16]。

2.1.3 乙醇体积分数对蓬蒿籽多酚得率的影响

在提取时间55 min、提取温度70℃、料液比1∶25 条件下，考察乙醇体积分数对蓬蒿籽多酚得率的影响，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对蓬蒿籽多酚得率的影响

由图3可知，当乙醇体积分数在40%～60%区间蓬蒿籽多酚得率呈上升趋势，在60%～80%区间蓬蒿籽多酚得率呈下降趋势，当乙醇体积分数为60%时，蓬蒿籽多酚得率最高，为14.83%。可能的原因是当乙醇体积分数较小时，淀粉、蛋白质、一些多糖以及果胶等部分亲水性物质会溶于乙醇溶液，影响多酚的提取[17]；当乙醇体积分数过高时会妨碍乙醇渗透进植物细胞，从而影响多酚的提取[18]。

2.1.4 提取时间对蓬蒿籽多酚得率的影响

在提取温度70℃、料液比1∶25、乙醇体积分数60%条件下，考察提取时间对蓬蒿籽多酚得率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对蓬蒿籽多酚得率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，蓬蒿籽多酚得率逐渐升高，在提取时间为65 min时，蓬蒿籽多酚得率最高，超过65 min时，蓬蒿籽多酚得率降低。可能是因为随着提取时间的延长，蓬蒿籽中的多酚会逐渐扩散到溶剂中，当达到一定的提取时间之后，蓬蒿籽多酚的溶解速度变慢，提取时间过长，会增加杂质溶出，多酚结构可能遭到破坏，从而导致得率下降。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 实验设计与结果

在单因素实验的基础上，采用四因素三水平的Box-Benhnken 中心组合设计实验，分别考察提取温度(X1)、料液比(X2)、乙醇体积分数(X3)及提取时间(X4)对蓬蒿籽多酚得率(Y)的影响。响应面实验因素水平见表1，响应面实验设计与结果见表2。

表1 响应面实验因素水平

表2 响应面实验设计与结果

2.2.2 响应面实验分析

对回归方程进行显著性检验分析，结果见表3。

表3 方差分析

2.2.3 最佳条件及验证实验

通过响应面优化分析，确定蓬蒿籽多酚最佳的提取条件为：提取温度74.55℃，料液比1∶27.16，乙醇体积分数52.63%，提取时间69.65 min。在最佳条件下，蓬蒿籽多酚得率预测值为20.25%。结合实际综合考虑，将理论值修正为提取温度75℃、料液比1∶27、乙醇体积分数53%、提取时间70 min,在此条件下进行3次平行实验，得到蓬蒿籽多酚得率为20.36%。实际值接近理论值，说明模型可靠。

2.3 蓬蒿籽多酚对油脂的抗氧化效果

2.3.1 蓬蒿籽多酚对不同油脂的抗氧化效果(见图5)

由图5可知，随着时间的延长，不同油样的过氧化值不断增大，未添加蓬蒿籽多酚的空白油样的过氧化值迅速增加，而添加蓬蒿籽多酚油样的过氧化值增速减缓。说明蓬蒿籽多酚对猪油、菜籽油及花生油的氧化酸败有不同程度的延缓作用。

图5 蓬蒿籽多酚对不同油脂的抗氧化效果

2.3.2 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂抗氧化活性比较(见图6)

图6 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂抗氧化活性比较

由图6可知，随着时间的延长，不同油样的过氧化值都有不同程度的增长，但添加抗氧化剂的油样的过氧化值都低于空白油样，添加蓬蒿籽多酚的油样的过氧化值低于添加BHA及柠檬酸的油样，高于添加BHT及抗坏血酸的油样。说明蓬蒿籽多酚的抗氧化能力强于柠檬酸和BHA，与BHT接近，低于抗坏血酸。

2.3.3 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂的协同作用对猪油抗氧化效果(见图7)

图7 蓬蒿籽多酚与其他抗氧化剂协同增效作用

由图7可知：随着时间的延长，空白油样的过氧化值迅速增大，而添加了蓬蒿籽多酚的油样过氧化值明显低于空白油样；各复配组对油样的抗氧化效果强于单一蓬蒿籽多酚组，复配组对猪油的抗氧化效果由强到弱为蓬蒿籽多酚+抗坏血酸>蓬蒿籽多酚+柠檬酸>蓬蒿籽多酚+BHT>蓬蒿籽多酚+BHA。蓬蒿籽多酚与有机酸实验组抗氧化效果的提高，可能是由于有机酸能够与油中一些金属离子螯合成金属盐，使油脂的催化能力降低，进而增加了蓬蒿籽多酚的抗氧化能力[19-20]。

3 结 论

本文在单因素实验的基础上，采用响应面实验对蓬蒿籽多酚提取工艺条件进行了优化，得到最佳的提取工艺条件为：提取温度75℃，料液比1∶27，乙醇体积分数53%，提取时间70 min。在最佳条件下，蓬蒿籽多酚得率为20.36%。蓬蒿籽多酚对油脂的抗氧化研究表明，蓬蒿籽多酚对猪油、菜籽油及花生油都有较好的抗氧化效果，蓬蒿籽多酚较柠檬酸和BHA对猪油的抗氧化效果好，并且与抗坏血酸、柠檬酸、BHA及BHT有协同增效作用。