衰减全反射太赫兹时域光谱法快速分析脯氨酸溶液

廖云生，李雪琴，刘钟栋

(河南工业大学 粮油食品学院，郑州 450001)

太赫兹(Terahertz，THz)是波动频率单位之一，通常是指频率在0.1～10.0 THz(波长为3000～30 μm)范围内的电磁波[1]。由于THz波的高穿透性、无损性以及低能性，因此其被视为食品检测的理想光源[2]。目前已有研究表明食品中糖类、脂质、蛋白质、维生素等主要成分皆在THz频段存在特征吸收峰[3-6]，这也从另外一个侧面反映出THz技术在食品无损检测方面具有一定的潜能。但是大多数食品样品都为含水的液态样品，而水分在太赫兹波段有极强的吸收，这就使得运用传统的透射式THz时域光谱在对食品样品进行检测时需要非常繁琐的预处理步骤，很难实现连续的快速检测[7]。此前便有报道提出了一种基于衰减全反射的太赫兹时域光谱仪，通过样品与全反射倏逝波的相互作用，获取样品的THz光谱[8]，并且证明了衰减全反射式太赫兹光谱与透射式太赫兹光谱是等效的[9]。与传统的透射式THz光谱技术相比，其操作更加简便，且其对于液体样品检测的准确性也能被验证[10]。

脯氨酸是人体合成蛋白质的18种氨基酸之一，常温下为无色至白色的晶体或结晶性粉末。其常用于食品领域，可直接用作营养增补剂、食品用香料等，同时也是合成某些食品、饲料添加剂的原料成分[11,12]。不管是在食品添加剂的生产还是运用方面，都需要对其进行实时快速的浓度检测，因此开发一种准确、高效、无损的检测方法具有重要意义。结合现行检测方法繁琐复杂的特点[13-17]，为了便于样品的连续快速检测，本研究采用基于衰减全反射技术的太赫兹时域光谱系统(ATR-THz TDS)来对不同浓度的脯氨酸样品进行定量识别研究。

1 材料与方法

1.1 样品制备

研究所用的脯氨酸试剂购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度≥99%，储存在常温下。样品在制备时分别将试剂溶于蒸馏水中配制成21组不同浓度的水溶液(0%～15%)，并选择15组样品用于建模，另外6组样品用作随机检验。

1.2 光谱测量

该实验是在含硅棱镜的TERA K15/SYNC太赫兹时域光谱仪(Menlo Systems GmbH，慕尼黑，德国)上进行ATR-THz TDS光谱测量，光谱范围为0.1～4.0 THz，光谱分辨率>1.2 GHz。该系统工作原理见图1：在该系统中，飞秒光纤激光器可以发射小于50 fs的脉冲产生飞秒激光(中心波长为1550 nm，重复频率为100 MHz，平均功率为20 mW)，经过分光镜分为探测光及泵浦光两束光。探测光直接入射至THz探测器的光导天线上，泵浦光通过时间延迟系统后聚焦汇聚至THz发射器的光导天线上产生THz波，产生的THz波以57°进入ATR棱镜，并且在其与样品相互作用的表面出现倏逝波，最后产生的携带有关样品信息的全反射太赫兹脉冲到达探测光导天线，经锁相放大器后得到THz时域信号。

图1 衰减全反射太赫兹时域光谱测量系统原理图Fig.1 Schematic diagram of terahertz time-domain spectroscopy measurement system based on attenuated total reflection technique

为了避免空气中水蒸气对THz波的影响，虚线框中显示的设备位于不停充装氮气的密封盒中，以确保在测量过程中将样品的湿度控制在2%左右，实验在室温(约294 K)下进行。实验时先使用移液枪将样品溶液吹打均匀，然后将2 mL的液体样品快速地加入ATR棱镜的样品池中，并立即采取样品信号。以不含液体样品的ATR棱镜作为参考信号，在每次进样前采取。为了减小随机误差，将样品扫描次数设置为2048次平均后作为该样本的光谱值，且每个样本信号及参考信号重复采取3次，将这3次重复的平均频谱用于进一步分析。在每次上样前都使用蒸馏水将样品池清洗干净，并用氮气将其吹至干燥。

1.3 数据处理

1.3.1 光谱提取

图2 ATR棱镜内部光路示意图Fig.2 ATR prism internal light path diagram

在ATR棱镜中(见图2)，入射的太赫兹脉冲完全反射到棱镜底部，在靠近样品-棱镜界面的样品内部会产生倏逝波，由于倏逝波和样品的相互作用，可以精确地测量时域信号中的时间延迟(Δφ)以及幅度差(ΔA)。时域信号的傅里叶变换得到频域中电场的振幅和相位，然后根据实验结果确定频域内的衰减全反射率R(ω)和相位谱φ(ω)[18]：

(1)

(2)

(3)

(4)

1.3.2 定量模型的建立

2 结果与分析

2.1 脯氨酸溶液的THz-ATR光谱

将实验测量的结果数据导入Origin软件，对光谱检测结果进行简单的分析整理后做出空白棱镜(参考信号)、纯水和脯氨酸溶液THz时域谱图，见图3。

图3 纯水与脯氨酸溶液的THz时域谱图Fig.3 THz time domain spectra of pure water and proline solution

由图3可知，利用ATR技术可以使得由于样品的强吸收而引起的振幅衰减大大减弱，并且纯水中由于脯氨酸的存在而导致了可见的变化，这也显示了ATR技术在测量THz区域中液体样品方面的优势。

不同浓度下的脯氨酸溶液样品在0.3～1.0 THz频段内的吸收谱图见图4。这些吸收谱图中的每个都是3个样品的平均值。受所使用的光谱系统自身性能原因影响，因此光谱频率从0.3 THz起始；在低于1.0 THz频率下，复折射率与结合水的弛豫动力学为主，而在1.0 THz以上的高频下，复折射率则受高频振动模式的控制，故在1.0 THz以上的高频下，样品对THz波的吸收更为强烈，吸收信号区分度很小，受噪声影响严重，因此不在光谱上显示。

图4 不同浓度的脯氨酸溶液在0.3～1.0 THz的吸收谱图Fig.4 Absorption spectra of different concentration of proline solution at 0.3～1.0 THz

由图4可知，所有浓度样品的吸收谱图在0.3～1.0 THz频段内均无明显特征峰，且它们的形状相似。在同一浓度下，吸收曲线随着频率增加而上升，这是由于样品自身吸收的原因。在相同频率下，吸收系数随着样品浓度的增加而降低，这是由于脯氨酸溶液中本体水的绝对量下降，这部分本体水与脯氨酸分子发生了水合，使得结合水的弛豫动力学发生变化所导致的。为了保证光谱系统的准确性，还对纯水进行了标定，通过计算得出纯水在1 THz处的吸收系数为230 cm-1，这符合先前报道中所描述的情况[19,20]。

2.2 脯氨酸溶液浓度的定量识别

综上所述，在0.5 THz处的复折射率行为主要由结合水的弛豫动力学所决定，因此为了进一步研究脯氨酸溶液的浓度与吸收系数之间的关系，将使用该频率下的吸收系数来评价脯氨酸溶液的浓度，分析了15个浓度的45个样品(每组浓度3次重复)。0.5 THz处脯氨酸溶液浓度和吸收系数关系散点图见图5，每个点是同一浓度下3个样品的平均值，误差条是每个浓度的标准偏差。

由图5可知0.5 THz处的吸收系数与浓度之间的线性趋势，并采用SLR方法建立了它们之间的拟合关系。得到的拟合回归模型为：y=-1.27x+160.01，R2=0.96，RMSE=4.23，线性关系良好。在所有情况下，吸收系数随着脯氨酸溶液浓度的增加而线性下降，这是由于该频率区域内的水合动力学变化导致复折射率的减小而决定的。

为了进一步评价模型性能的优劣程度，使用上述建立的拟合回归模型对6组浓度的18个预测样品(每组浓度3次重复)进行分析计算得到相应的浓度预测值。将真实值作为横坐标，计算得出的预测值作为纵坐标绘制出散点图，并进行线性回归分析，建立二者之间的拟合关系。得到的拟合回归模型为：y=0.99x-0.13，R2=0.99，RMSE=0.51，线性关系极好。模型的真实值与预测值之间的关系见图6。

图6 真值与预测值关系图Fig.6 Relationship graph between actual value and predicted value

由图6可知，通过SLR方法建立吸收系数与浓度之间的拟合关系，得到的回归模型的预测浓度与真实值极为接近，表明该模型对未知浓度的脯氨酸溶液的预测能力非常优秀。

3 结论

采用基于衰减全反射的太赫兹时域光谱法快速地定量分析了不同浓度的脯氨酸溶液，且通过计算分析将这些浓度的脯氨酸溶液在0.3～1.0 THz的频率范围内进行了建模分析，利用SLR方法对在0.5 THz处的样品浓度及吸收系数之间的关系进行定量分析，并且使用所得到的拟合回归模型对几组样品进行了浓度预测。实验结果表明，采用SLR方法拟合的模型来评估脯氨酸溶液的浓度其性能非常好，其R2为0.96，RMSE值低，又对预测样品的真值与预测值之间的关系进行了建模，得出其真值与预测值之间的R2无限接近于1，RMSE值非常低，证明了该分析方法可以得到极好的预测结果。此外，该方法与其他方法相比无需进行繁琐的样品前处理步骤，且上样简单方便，便于连续检测，是非常理想的THz频段液态样品的检测方法。总的来说，本研究结果不仅为脯氨酸水溶液的快速定量识别提供了可行的理论基础，而且也展露出基于衰减全反射的太赫兹时域光谱技术对食品加工生产过程中其他液态成分进行实时浓度分析的巨大潜能。