海英菜乙醇提取物抗氧化活性的研究

吕新河

(南京旅游职业学院,南京 211100)

海英菜，嫩苗俗称“狼尾巴条”。海英菜属一年生草本植物。海英菜的嫩茎叶食用方式比较丰富，同时海英菜便于贮藏和运输，因此海英菜拥有良好的开发前景[1-3]。随着社会的发展，人们日趋重视“绿色食品”，讲求天然。目前海英菜已成为沿海地区较有名气的特色佐餐小菜和调味品。

近年来，对于海英菜的研究资料相对较少，尤其是全面性地研究海英菜的抗氧化能力[4-6]。现代生物学认为活性氧和体内自由基增多是促进衰老进程的主要原因，目前国内学者对天然提取物体外抗氧化的研究大多是从自由基的清除角度来进行论证。因此，本试验使用自由基DPPH·、过氧化氢H2O2体系、羟自由基·OH体系、脂质过氧化抑制能力、还原能力为评价指标，对海英菜的体外抗氧化活性及细胞学免疫活性进行研究，并对其体外抗氧化活性的变化趋势进行分析，为充分利用海英菜潜在的天然抗氧化剂开发功能性食品、调味品提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料与处理

海英菜购自农贸市场，冷冻干燥，然后用万能粉碎机磨成粉末，放在干燥器中备用。

1.2 主要试剂与仪器设备

1.2.1 主要试剂

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、TCA、BHT、三氯化铁、双氧水、氢氧化钠、甲醇、乙酸、邻苯三酚、Tris、盐酸、DPPH、乙酸乙酯、硫酸亚铁、苯酚、浓硫酸、85%磷酸、水杨酸、亚硝酸钠、硝酸铝、无水碳酸钠：以上试剂均为分析纯。

1.2.2 仪器设备

FA1256B型电子分析天平 浙江飞衡仪器公司；738GA-100型紫外可见分光光度计 上海精密仪器公司；ULT1569-6-S型超低温冰箱 美国Revco公司；ALZAK 1-3BA Plus冻干机 德国Marin Christ公司；L8-3KR低温离心机 上海三利仪器公司；LA纤维超滤装置 上海博纳设备公司；高压灭菌锅 山东博科公司；SCB恒温水浴锅 广州耀特仪器公司；FSH-3B组织匀浆器 苏州亿能仪器公司。

1.3 海英菜乙醇提取物的制备

称取一定量的海英菜粉末，按照1∶60的料液比混合，置于55 ℃恒温水浴锅中磁力搅拌浸提4 h，抽滤得上清液，蒸发浓缩后，置于铝盒中，冷却至室温后放入-75 ℃超低温冰箱中预冻，冷冻干燥，得到乙醇提取物，称重，置于干燥器皿中待用。

1.4 海英菜乙醇提取物体外抗氧化活性研究

1.4.1 过氧化氢清除率的测定

测定参照Mu等[7]的方法并加以修改，实试验步骤如下：将提取物干燥粉末溶于蒸馏水中，配制成5种不同浓度的受试物：0.1，0.2，0.4，0.8，1 mg/mL。用pH为7.4的磷酸盐缓冲液配制10 mmol/L的过氧化氢溶液，取受试物2 mL与过氧化氢2 mL，混匀，磷酸缓冲液调零，在248 nm下测定吸光度，记作A1。取4 mL过氧化氢，在248 nm下测吸光度，记作A0。取2 mL受试物与2 mL磷酸缓冲液混匀，在248 nm下测吸光度，记作A2。按照下式计算清除率，以Vc作为对照，试验重复3次，并对结果进行统计分析。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

1.4.2 羟基自由基清除率的测定

测定参照Ahmad等[8]的方法并加以修改，试验步骤如下：将提取物干燥粉末溶于蒸馏水中，配制成5种不同浓度的受试物：0.1，0.2，0.8，1，4 mg/mL。取1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇、1 mL受试物，再加入1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢启动整个反应，混匀，37 ℃水浴反应30 min，在510 nm下测吸光度，记作A1。以蒸馏水代替过氧化氢，在510 nm下测吸光度，记作A2。以蒸馏水代替受试物，加入过氧化氢启动整个反应，在510 nm下测定吸光度，记作A0。按照下式计算清除率，以Vc作为对照，试验重复3次，并对结果进行统计分析。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

1.4.3 DPPH·清除率的测定

测定参考Martha等[9]的方法并稍作修改，试验步骤：将制得的样品用蒸馏水调制为以下不同质量浓度梯度：0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。量取2.0 mL调配好的试样溶液与2.0 mL DPPH·乙醇溶液混合，常温下反应0.5 h，测定517 nm处的吸光值，记作Ai。取2 mL DPPH·乙醇溶液与2.0 mL无水乙醇重复以上步骤，测定值记作Ac。取2.0 mL试样溶液与2.0 mL无水乙醇溶液重复以上步骤，测定值记作Aj。按照下式计算清除率，以Vc作为对照，试验重复3次，并对结果进行统计分析。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

1.4.4 脂质过氧化抑制率的测定

抗脂质过氧化的测定主要参考Karigidi等[10]的方法并稍作修改，试验步骤如下：将制得的样品用蒸馏水调制为以下不同质量浓度梯度：0.1，0.2，0.4，0.8，1 mg/mL。取1.2 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)，然后依次加入2 mL不同浓度梯度的样品，0.4 mL稀释蛋黄液(用磷酸盐缓冲液以1∶50稀释)以及0.4 mL FeSO4(25 mmol/L)，混合均匀后在37 ℃水浴振荡20 min。水浴结束后加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)，摇匀后室温静置10 min，10000 g离心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL 0.8% TBA混匀，沸水浴15 min，待冷却后在532 nm处测定吸光值，记作A1。以蒸馏水代替受试物进行上述相同操作，在532 nm处测定吸光值，记作A0。以蒸馏水代替TBA溶液进行上述相同操作，在532 nm处测定吸光值，记作A2。按照下式计算清除率，以Vc作为对照，试验重复3次，并对结果进行统计分析。

抑制率(%)=(1-( A1-A2)/A0)×100%。

1.5 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠巨噬细胞的保护作用

1.5.1 小鼠巨噬细胞的提取

小鼠巨噬细胞的提取主要参考Anuradha等[11-13]的方法并稍作修改。将7周龄C57雌性小鼠脱颈处死，置于70%乙醇中浸泡2 min。在无菌操作台内将小鼠固定在消毒后的泡沫板上，用灭菌的剪刀和镊子剥离表皮(注意不要破坏腹腔粘膜)。用酒精棉球轻轻擦拭腹膜，再用灭菌后的50 mL注射器吸取1640培养液15 mL缓缓注入腹腔，然后吸出，反复操作10次，将吸出液体注入15 mL灭菌离心管中，用封口胶封口，在4 ℃，1500 r/min条件下离心5 min，离心后在无菌操作台中，倒出上清液，用灭菌后的PBS溶液洗涤1次，转移到1.5 mL离心管中，封口，在4 ℃，1500 r/min条件下离心5 min，以上清洗操作重复3次。清洗结束后用1640培养液重悬备用。

1.5.2 抗氧化指标的测定

抗氧化指标的测定主要参考Shuji等[14-16]的方法并稍作修改。将96孔培养板从培养箱中取出，培养液分别按对应的顺序转移到1.5 mL离心管中，封口，在4 ℃，1500 r/min条件下离心5 min，弃去上清液。用PBS缓冲液悬浮，经超生粉碎细胞，3000 r/min离心15 min，取上清液制成匀浆。按照试剂盒方法测定超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量。

1.6 数据处理

本试验检测数据以均数±标准差表示，数据分析运用SPSS 19.0软件。运用Microsoft Excel 2003软件绘制统计图。

2 结果与分析

2.1 海英菜乙醇提取物的体外抗氧化活性研究

2.1.1 海英菜乙醇提取物对过氧化氢清除率的影响

图1 海英菜乙醇提取物对H2O2清除率的影响Fig.1 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the scavenging rate of H2O2

由图1可知，同一样品在不同浓度下，在浓度范围内，海英菜乙醇提取物对过氧化氢都有一定的清除能力，海英菜乙醇提取物对过氧化氢的清除率随着样品浓度的增大而升高。当浓度达到1 mg/mL时，海英菜乙醇提取物的清除率最大值为91.2%。而Vc的清除率达到了93.8%。在0.1～0.2 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对过氧化氢的清除能力显著提高。在0.4～0.8 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对过氧化氢清除能力的变化并不明显。

2.1.2 海英菜乙醇提取物对DPPH·自由基清除率的影响

图2 海英菜乙醇提取物对DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the scavenging rate of DPPH free radical

由图2可知，同一样品在不同浓度下，样品对DPPH·的清除率随浓度的升高而增加。并且随着样品浓度的增加，海英菜乙醇提取物的清除率也有显著性差异(P<0.05)。然而Vc随样品浓度增加所表现出的清除能力的差异性不显著(P>0.05)。在0.1～0.2 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对DPPH·的清除能力显著提高。在0.4～0.8 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对DPPH·清除能力的变化不明显。在浓度范围内，当浓度达到1 mg/mL时，海英菜乙醇提取物对DPPH·的清除能力最大，为86.7%。当浓度达到0.1 mg/mL时，海英菜乙醇提取物对DPPH·的清除能力最小，为48.52%。

2.1.3 海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率的影响

海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率的影响见图3。

图3 海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率的影响Fig.3 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the inhibition rate of lipid peroxidation

由图3可知，同一样品在不同浓度时，海英菜乙醇提取物对脂质过氧化的抑制能力都随着浓度的增加而增强。海英菜乙醇提取物在浓度超过0.1 mg/mL以及不超过0.8 mg/mL时，所表现出的抑制能力具有较显著的差异性(P<0.05)，而浓度在0.8～1.0 mg/mL之间，所表现出的抑制能力表现出的差异性则不显著(P>0.05)。然而，Vc的还原能力随浓度变化所产生的差异不显著(P>0.05)。在0.1～0.8 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率显著提高。在0.8～1 mg/mL浓度范围内，海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率的变化不明显。在浓度范围内，当浓度达到1 mg/mL时，海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率最大，为87.88%。当浓度达到0.1 mg/mL时，海英菜乙醇提取物对脂质过氧化抑制率最小，为7.38%。

2.2 海英菜乙醇提取物对小鼠巨噬细胞的保护作用

2.2.1 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞SOD活性的影响

海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞SOD活性的影响见图4。

图4 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞SOD活性的影响Fig.4 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on SOD activity of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由图4可知，H2O2损伤组的SOD活性相对于正常组有显著降低(P<0.05)。在提取物浓度为200,400,800 mg/mL时，细胞内SOD活性与损伤组相比有显著增高，并且随着浓度的提高，变化越显著(P<0.05)。当提取物浓度达到800 mg/mL时，SOD活性与正常组相比存在显著的差距，可能是提取物对SOD活性的恢复达不到正常的活性值(P<0.05)。结果表明，海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞SOD活性有一定的恢复作用。

2.2.2 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px活性的影响

海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px活性的影响见图5。

图5 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px活性的影响Fig.5 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on GSH-Px activity of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由图5可知，H2O2损伤组的GSH-Px活性相对于正常组显著降低(P<0.05)。当提取物在200,400,800 mg/mL浓度时，相对于损伤组细胞内GSH-Px的活性显著增高，并且浓度越高，GSH-Px的活性越大(P<0.05)。当提取物浓度在400 mg/mL时，与200,800 mg/mL均无显著差异，可能是因为提取物浓度不够，对GSH-Px活性的影响不大。结果表明,海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px活性有一定的恢复作用且效果显著。

2.2.3 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量的影响

海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量的影响见图6。

图6 海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量的影响Fig.6 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on MDA content of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由图6可知，H2O2损伤后细胞内MDA含量相对于正常组显著升高(P<0.05)。当提取物浓度在200,400,800 mg/mL时，随着浓度增大，细胞内MDA含量相对于损伤组显著降低(P<0.05)。当提取物浓度在800 mg/mL时，细胞内MDA含量相对正常组水平有显著差异(P<0.05)，可能是提取物还没有达到最适浓度。结果表明，海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量有明显的降低作用。

3 结论

本试验用乙醇从海英菜中提取出抗氧化物质，通过对自由基的清除能力来对海英菜的体外抗氧化性进行研究，得出以下结论。

试验结果表明海英菜乙醇提取物对H2O2有清除作用，随着浓度的升高，且在高浓度时与Vc相近。海英菜乙醇提取物对DPPH·有一定清除作用，随着浓度的增加而增加，但弱于Vc对DPPH·的清除作用，并且相差较大。海英菜乙醇提取物都具有一定的还原力，随浓度的升高而变大。尤其在受试样品低浓度时，海英菜乙醇提取物的还原力与Vc的还原力相差很大。不同受试剂量的海英菜乙醇提取物均有抑制脂质过氧化的能力，且随着浓度的升高而增强。在高浓度时，海英菜乙醇提取物的抑制能力与Vc相近。

海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞SOD活性有一定的恢复作用。海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞GSH-Px活性有一定的恢复作用且效果显著。海英菜乙醇提取物对H2O2损伤后小鼠腹腔巨噬细胞MDA含量有明显的降低作用。

不同受试剂量的海英菜乙醇提取物均具有一定的抗氧化性，能够很好地清除多种自由基，预防许多自由基引起的老化及相关疾病。此外，海英菜调味类小菜可作为潜在的天然抗氧化剂和食品、菜肴保鲜剂，为下一步的食品保鲜研究提供理论基础。随着食品技术应用的发展，海英菜具有广阔的开发和应用前景。